پزشکی بالینی

PDF متن کامل روش

كروماتوگرافي عبارت جامعي است براي يك مجموعه از تكنيك‌هاي آزمايشگاهي مورد استفاده در جداسازي تركيب‌ها. ماده مركب در يك مايع به نام فاز متحرك حل مي‌شود و در طول  ماده ي ديگري به نام فاز ايستا حركت مي‌كند. اجزاي مختلف تركيب، با سرعت‌هاي متفاوت حركت مي‌كنند و لذا از هم جدا مي‌شوند.  

كـرومـاتـوگـرافـي مـي‌تـوانـد تحليلـي يـا توليدي باشد. هدف كروماتوگرافي توليدي، جداسازي اجزاي يك

تركيب براي كاربرد در جاهاي ديگر است. كروماتوگرافي تحليلي  با مقادير كمتري از مـاده انجـام مـي‌شـود و بـراي انـدازه‌گيـري نسبت آناليت‌ها در يك تركيب است.
دو روش اصـلــي كــرومــاتـوگـرافـي عبـارتنـد از كــرومــاتــوگــرافــي مــايــع و گـاز (GC). در شـكـل 1  روش‌هـاي مختلـف كـرومـاتوگرافي، نشان داده شده‌اند. 
كروماتوگرافي را مي‌توان براي خالص سازي مـواد، شنـاسـائـي تـركيبـات و كمّي كردن ميزان و مقادير استفاده كرد. HPLC، GC و كروماتوگرافي لايه نازك (TLC)، در آزمايشگاه‌هاي سم شناسي رايج  بوده و براي كمي كردن سطح دارو در سرم در مـانيتـوركـردن داروهاي درماني و شناسايي دارو مفيـداسـت. كـرومـاتـوگـرافـي مـايـع در آزمـايشگاه باليني در سنجش ويتامين‌ها و هورمون‌هاي خاص (و‌متابوليت‌هاي آن‌ها) نيز استفاده مي‌شود. 

تاريخچه
كروماتوگرافي يا نوشتن با رنگ، در ابتدا توسط دانشمند روسي به نام Mikhail Tsvet در 1900 به كار

گرفته شد. او كار با كروماتوگرافي را در دهه ي اول قرن بيستم ادامه داد و ابتدا ازآن براي جداسازي رنگدانه‌هاي گياهان استفاده كرد. از آنجا كه اين اجـزا، رنـگ‌هاي متفاوتي دارند (سبز، نارنجي و زرد) لـذا نـامگـذاري اين تكنيك بر همين اساس صورت گرفته است. انواع جديد كروماتوگرافي در طول 1930 و 1940 ايجاد شدند و اين تكنيك را بــراي بـسـيــاري از فــرايـنــدهــاي جـداسـازي مفيـد كردند.
تكنيك كروماتوگرافي در نتيجه ي كار Archer Hohn Porter Martin و Richard Laurence Millington Synge در دهه‌هاي 40 و 50 به صورت اساسي توسعه يافت. آن‌ها اصول وتكنيك‌هاي پايه ي كروماتوگرافي partition را ايجاد كردند و كار آن‌ها منجر به توسعه‌ي سريع چند روش كروماتوگرافي شد: كروماتوگرافي كاغذ، كروماتوگرافي گاز و كروماتوگرافي مايع با كارائي بالا. از آن زمان به بعد، تكنولوژي به سرعت پيشرفت كرده است. محققان دريافته‌اند كه اصول پايه‌ي Tsvet را مي‌توان به روش‌هــاي مـخـتـلـفــي اعـمــال كـرد كـه منجـر بـه انـواع مختلـف كـرومـاتـوگـرافـي مـي‌شـود. پيشرفت‌ها در اين حوزه همچنان ادامه دارند و امكان جداسازي هر چه بيشتر مولكول‌هاي مشابه را فراهم مي‌كنند.

عبارت هاي اصلي در  كروماتوگرافي
آناليت: ماده‌اي كه هدف، جداسازي آن در طول كروماتوگرافي است.
كـرومـاتـوگـرافي تحليلي: براي تعيين وجود و  غلظت آناليت در يك نمونه استفاده مي‌شود.
كروماتوگرام: خروجي ديداري كروماتوگراف است. در حالتي كه جداسازي به صورت بهينه انجام شده باشد،  قله‌هاي متفاوت روي كروماتوگرام، متناظر با اجزاي مختلف در تركيب  است.
مـحـور x زمـان مـاندگاري و محور عمودي، سيگنال متناظر با پاسخ ايجادشده توسط آناليت‌هاي موجود در سيستم است.
كروماتوگراف ‌دستگاهي است كه امكان جداسازي حرفه‌اي را فراهم مي‌كند، به عنوان مثال جداسازي كروماتوگرافيك مايع يا گاز.
محصول شويش ‌يا Eluate: فاز متحركي است كه از ستون خارج مي‌شود.
شوينده ‌يا Eluent حلالي است كه آناليت را حمل مي‌كند.
سري eluotropic ليستي از حلال‌هاست كه طبق توان شويندگيشان مرتب شده‌اند.
فاز ثابت (immobilized)، يك فاز ايستا است كه  درون ستون كروماتوگرافي ثابت شده است.
فاز متحرك ‌فازي است كه در يك جهت معين حركت مي‌كند. مي‌تواند مايع (LC)، گاز (GC) يا يك مايع (supercritical (SFC باشد. فاز متحرك متشكل از نمونه اي كه قرار است جدا/تحليل شود و حلالي كه نمونه را در طول ستون پيش مي‌برد، است. در مورد HPLC فاز متحرك متشكل از حلال (هاي) غيرقطبي مانند hexane در فاز طبيعي يا حلال‌هاي قطبي در كروماتوگرافي فاز معكوس و نمونه اي كه قرار است جدا شود است. فاز متحرك در طول ستون كروماتوگرافي (فاز ايستا) حركت مي‌كند و در اين زمان، نمونه‌ها با فاز ايستا تعامل مي‌كنند و جدا مي‌شوند.
كروماتوگرافي توليدي ‌براي  جداسازي مقادير كافي از يك ماده براي استفاده‌هاي بعدي- و نه تحليل - استفاده مي‌شود.
زمان ماندگاري ‌زماني است كه طول مي‌كشد تا يك آناليت خاص، تحت شرايط set از سيستم عبور كند (از ورودي ستون تا دتكتور.)
نمونه ‌ماده اي است كه در كروماتوگرافي تحليل مي‌شود. مي‌تواند يك جزء داشته باشد يا تركيبي از اجزاي مختلف باشد. 
ماده ي حل شده ‌يا Solute اجزاي نمونه در كروماتوگرافي partition هستند.
حلال ‌هر ماده اي است كه بتواند ماده ي ديگري را حل كند و به صورت خاص، به فاز مايع متحرك در كروماتوگرافي مايع گفته مي‌شود.
فاز ايستا ماده اي است كه در فرايند كروماتوگرافي در جاي خود ثابت است؛ به عنوان مثال، لايه ي سيليكا در كروماتوگرافي لايه نازك.

كروماتوگرافي ستوني
كروماتوگرافي ستوني يك تكنيك جداسازي است كه درآن بستر ايستا داخل يك لوله است. ذرات فاز ايستاي جامد يا  فاز ايستاي مايع، ممكن است كل حجم داخلي لوله را پر كنند يا در طول ديواره ي داخلي لوله متمركز شده باشند و مسيري براي فاز متحرك در بخش مياني لوله باقي مانده باشد. 
در 1978 W.C. Still يك نسخه ي اصلاحي براي كروماتوگرافي ستوني ايجاد كرد كه كروماتوگرافي ستوني flash ناميده مي‌شود. اين تكنيك بسيار مشابه روش كروماتوگرافي ستوني سنتي بود با اين تفاوت كه حلال با اعمال فشار مثبت در طول ستون  حركت مي كند. ايـن باعث مي‌شود كه اغلب جداسازي‌ها در كمتر از 20 دقيقه انجام شوند و به‌علاوه جـداسـازي در مقـايسـه بـا روش‌هـاي قـديمـي بهتـر انجـام مي‌شود. استفاده از پمپ‌هاي گراديان(چند پمپ هم زمان)  منجر به جداسازي سريع‌تر و مصرف حلال كمتر مي‌شود.

كروماتوگرافي سطحي
كروماتوگرافي سطحي تكنيك جداسازي است كه در آن فاز ايستا، يك صفحه است. صـفـحـه مـي‌تـوانـد كـاغـذي بـاشـد كـه بـا مـاده اي بـه عـنـوان بـسـتـر ايـسـتا بارور شده است (كروماتوگرافي كاغذ) يا لايه اي از ذرات جامد توزيع شده روي يك ساپورت مانند يك صفحه ي شيشه‌اي (كروماتوگرافي لايه نازك) باشد. تركيبات متفاوت در نمونه بر اساس مـيــزان تـعــامـلـشــان بـا فـاز ايستـا در مقـايسـه بـا فـاز متحرك، مسافت‌هاي مختلفي را طي مي‌كنند. 
كروماتوگرافي كاغذ
در كــرومــاتــوگــرافــي كــاغــذ، خـط يـا نـقـطـه ي كـوچكـي از محلـول نمـونه روي نواري از كاغذ كروماتوگرافي قرار داده مي‌شود. كاغذ در شيشه  حاوي لايه ي نازكي از حلال قرار داده شده و در آن بسته مي‌شود. همين طور كه حلال از كاغذ بالا مي‌رود ماده مركب هم همراه با حلال شروع به بالارفتن مي‌كند. اين كاغذ از سلولز ساخته شده است كه يك ماده ي قطبي است و اگر ذرات داخل تــركـيــب، غـيــرقـطـبــي بــاشـنــد، ســريــع‌تـر حـركـت مي‌كنند. مواد قطبي تر، سريع‌تر با كاغذ سلولزي تـركـيـب مي‌شوند و بنابراين خيلي حركت نمي كنند.

كروماتوگرافي لايه نازك
كـرومـاتوگرافي لايه نازك (TLC) يك تكنيك آزمـايـشـگـاهـي بـا كـاربرد وسيع است كه شبيه به كروماتوگرافي كاغذ است. به جاي استفاده از فاز ايستاي كاغذي، فاز ايستاي آن يك لايه ي نازك جاذب سطحي مانند ژل سيليكا ، اكسيد الومينيوم يا سلولز روي يك ماده ي مسطح و بي اثر است. در مـقـايـسـه بـا كـاغـذ مـزايـائـي دارد از جمله حركت سـريـع‌تـر، جـداسـازي بـهـتـر و امكان انتخاب بين جاذبه‌اي سطحي مختلف. براي رزولوشن بهتر و امكان كمّي سازي، مي‌توان از TLC با كارائي بالا استفاده كرد.

كروماتوگرافي جابجائي 
در  كروماتوگرافي جابجائي  مولكولي با ميل تـركـيـبـي زيـاد بـه مـاتـريـس كـرومـاتـوگـرافـي، تمام مولكول‌هاي با ميل تركيبي كمتر را جابجا مي‌كند. سرعت حركت هر يك از اجزاي يك تركيب  به عـوامـل زيـادي دارد. امـا بـراي ايـن كـه دو مـاده بـا سرعت‌هاي متفاوت حركت كرده و بر اين اساس از هـم جـدا شـونـد بـايد تفاوت قابل توجهي بين واكنش بيومولكول‌ها و ماتريس كروماتوگرافي وجود داشته باشد.

تكنيك‌هاي حالت فيزيكي فاز متحرك كروماتوگرافي گاز
كروماتوگرافي (GC) كه گاهي كروماتوگرافي گاز-مايع (GLC) هم ناميده مي‌شود، يك تكنيك جـداسـازي است كه در آن فاز متحرك يك گاز اسـت. كروماتوگرافي گاز هميشه در يك ستون انجام مي‌شود كه معمولا packedو  مويينه است.
كروماتوگرافي گاز بر اساس معادله ي جزءبندي آناليت بين فاز ايستاي جامد (اغلب يك ماده بر اساس سيليكون مايع) و گاز متحرك (اغلب هليوم) است. فاز ايستا داخل يك لوله ي شيشه‌اي با قطر كوچك (يك ستون مويرگي) يا يك ماتريس جامد داخل يك لوله ي فلزي بزرگتر (يك ستون packed)  مي‌چسبد. اين به صورت گسترده‌اي در شيمي تحليلي استفاده مي‌شود. گرچه دماي بالاي مورد استفاده در GC آن را براي پروتئين‌ها يا بيوپليمرهاي با وزن مــولـكــولــي بــالا نــامـنـاسـب مـي‌سـازد؛  ولـي بـراي استفـاده در حـوزه‌هـاي شيمـي صنعتـي، remediation، مانيتورينگ محيطي و پتروشيمي بسيار مناسب است.

كروماتوگرافي مايع
كروماتوگرافي مايع (LC) يك تكنيك جداسازي است كه در آن فاز متحرك، مايع است. كروماتوگرافي مايع را مي‌توان در يك ستون يا يك صفحه انجام داد. كروماتوگرافي مايعي كه امروزه انجام مي‌شود، معمولا از ذرات packing بسيار كوچك و يك فشار نسبتا بالا استفاده مي‌كند و كروماتوگرافي مايع با كارائي بالا (HPLC) ناميده مي‌شود.
همان طور كه ذكر شد كروماتوگرافي، فرايندي براي جداسازي اجزاي نمونه بر اساس تفاوت در ميل تركيبي آن‌ها با دو محيط مختلف به نام فاز متحرك و فاز ايستا  است. فاز متحرك (حلال شستشو) گاز يا مايعي است كه از داخل فاز ايستا (جاذب) مي‌گذرد. فاز ايستا به نحوي پيكربندي مي‌شود كه اجزاي نمونه به سطح آن بچسبند؛ در HPLC اين فاز يا مايع تركيب شده با جامد (معمولا سيليس و/يا پليمرهاي آلي) است يا مايعي است كه فاز متحرك  با يك پمپ در فشار بالا   (به عنوان مثال 5000 پوند بر اينچ مربع psi)، از درون آن  عبور مي‌كند. اجزاي نمونه كه حل پذيري بيشتري در حلال يا ميل تركيبي كمتري به جاذب (sorbent) دارند، سريع‌تر حركت كرده و مسافت بيشتري جلو مي‌روند.
تــكــنــيـــك‌هـــاي HPLC بـــراي مـــانــيــتـــوركــردن داروهــائــي مــانـنــد عــوامــل ضــدآريـتـمــي، آنـتــي‌بـيــوتـيــك‌هـا، داروهـاي ضـدصـرع، مـسـكـن‌هـا، شـل كـنـنـده‌هـاي عـضـلات  بـرونـش (bronchial) و داروهاي ضدافسردگي tricyclic استفاده مي‌شوند. يك اجراي كروماتوگرافي مـــي‌تـــوانـــد هـمـــزمـــان چـنــديــن دارو و بــرخــي از مــتـــــابـــــولــيــــت‌هــــاي آن‌هــــا را تــجــــزيــــه كــنــــد. در كـرومـاتـوگـرافـي مـايـع از حلال‌هاي فاز متحرك استفاده مي‌شود كه مي‌تواند به راحتي تركيبات قطبي مانند آن‌هائي كه در مايعات بدن وجود دارند را حل كند و لذا مي‌تواند به آساني پروتئين‌ها و پپتيدها را تفكيك كند.
مزيت اصلي HPLC نسبت به GC اين است كه GC از دمـاهاي بالا استفاده مي‌كند كه اكثر مواد بـيـــولـــوژيـكـــي مـــانـنـــد اسـيـــدآمـيـنــه‌هــا را دنــاتــوره (denature) يــا تخـريـب مـي‌كنـد. تقـريبـاً 80 تـا 85 درصـد تـمـام تركيبات شيميائيرا  كه جرم آن‌ها كمتر از 100 تا چندين ميليون دالتون است  مي‌توان با تكنيك‌هاي HPLC آناليز كرد. به علاوه عموما در HPLC نـسـبت به GC نياز به آماده سازي كمتري براي نمونه است. 
در HPLC نـمـونـه تـوسط يك مايع با فشار بالا (فاز‌متحرك) در يك ستون هل داده مي‌شود. اين ستون با فاز ايستاي متشكل از ذرات كروي شكل يا با شكل نامنظم، يك لايه ي متخلخل يكپارچه يا يك غشاي متخلخل، packed شده است. HPLC بـر‌اسـاس قـطبيت فازهاي متحرك و ايستا به دو زيـركـلاس متفاوت تقسيم مي‌شود: روش‌هايي كه در آن‌ها فاز ايستا قطبي تر از فاز متحرك است (بـه عـنـوان مـثـال toluene بـه عـنـوان فـاز مـتحرك، سيليكا به عنوان فاز ايستا) كروماتوگرافي مايع با فــاز طـبـيـعــي نــامـيــده (NPLC) نــامـيـده مـي‌شـود و معكوس اين حالت، (به عنوان مثال تركيب آب- متانول به عنوان فاز متحرك و =octadecylsilyl18C بــه عـنــوان فــاز ايـسـتــا) كــرومــاتـوگـرافـي مـايـع فـاز مـعـكــوس (RPLC) نـامـيـده مـي‌شـود. فـاز طـبـيـعـي كاربردهاي كمتري دارد و لذا RPLC به صورت قابل توجهي بيشتر استفاده مي‌شود. 

اصول عملكرد  HPLC

شكل(2) اجزاي نوعي از سيستم HPLC را نشان مي‌دهد. پمپ تضمين مي‌كند كه يك جريان ثابت وبدون پالس  فاز متحرك از مخزن به بقيه ي سيستم وجـود داشـتـه باشد. مرسوم‌ترين سيستم تحويل، پمپ با جابجائي ثابت، بر اساس يك پمپ پيستوني رفت و برگشتي است كه حلال‌ها را با جريان ثابت  عبورمي‌ دهد. نوع ديگر آن پمپ فشار ثابت است. پمپ‌ها بايد بتوانند حلال‌ها را با فشاري در بازه ي 500 تا 5000  psi حركت دهند. پمپ‌ها و  قطعات آن‌ها معمولا از جنس مقاوم در برابر مواد شيميائي مانند استيل ضدزنگ يا تفلون ساخته مي‌شود. 

پمپ HPLC
پمـپ HPLC مي‌تواند در مود isocratic يا مود گـراديـان عمـل كنـد. در مـود isocratic از يـك فاز متحـرك در كـل اجرا استفاده مي‌شود و معمولا بــراي تــركـيـبــاتـي بـا سـاختـارهـاي مشـابـه استفـاده مي‌شود؛ زيرا در يك زمان منطقي جدا مي‌شوند. مودگراديان براي نمونه‌هاي پيچيده تر و تركيبي اسـتـفـاده مـي‌شـود و مي‌تواند با تغيير تركيب فاز متحرك در طول اجرا، شستشوي چند جزئي را تسريع دهد؛ اين كار با تركيب دو يا چند حلال به صورت پله اي يا پيوسته، طبق يك برنامه ي از پيش تعيين شده انجام مي‌شود. مود گراديان را مي‌توان به دو صورت پياده سازي كرد: 1-با استفاده از يك سـيـسـتـم تـركـيب فشار بالا كه در آن حلال‌ها به صورت جداگانه با دو يا سه پمپ اعمال مي‌شوند (با يك كنترل‌كننده‌ي گراديان تنظيم مي‌شود) و در سمت فشار بالاي سيستم با هم تركيب مي‌شوند. 2- يــك سـيـسـتــم تــركـيـب فـشـار پـائـيـن كـه در آن كنترل‌كننده‌ي گراديان، توزيع دو يا چند حلال را از طـريـق دريچـه‌هاي تناسب (سوئيچ) متصل به دريچه‌ي ورودي يك پمپ، تنظيم مي‌كند. يك مــزيــت سيستـم تـركيـب فشـار بـالا ايـن اسـت كـه مي‌تواند در صورت لزوم به سيستم‌هاي isocratic جـداگـانـه تـبـديـل شـود (بـايد بيش از يك دتكتور موجود باشند)؛ در حالي كه سيستم فشار پايين، سادگي بيشتري دارد.

گاززدايي
فــاز مـتـحــرك، بــايــد قـبـل از اسـتـفـاده، فـيـلـتـر و گاززدايي شود تا قله‌هاي اشتباهي (حباب‌ها) و نيز هر گونه ذره‌اي از بين برود. گاززدائي با گرم كردن، بـازروان كـردن (refluxing) و وكيوم كردن بطري حــلال، يــا بــا قــرار دادن آن در مـعــرض ارتـعـاش اولــتــــراســــونــيــــك انــجـــام مـــي‌شـــود؛ گـــاززدائـــي، حباب‌هاي هوا را قبل از اين كه از دتكتور بگذرند، از فاز متحرك حذف مي‌كند. حباب‌هاي هوا در دتكتـور مي‌توانند يك خط پايه ي ناپايدار ايجاد كنند. اكسيژن زدائي كه با واردكردن هليم به مدت 30 دقيقه در حلال نيز انجام مي‌شود مانع از اين مي‌شود كه اكسيژن با حلال واكنش دهد يا روي نتيجه HPLC تاثير بگذارد. 

تزريق  نمونه
انژكتور نمونه به نحوي طراحي شده است كه نمونه را به صورت يك slug باريك تزريق كند .(به عنوان مثال 0.5‌ تا 50 ميكروليتر براي تست تحليلي) تا  باريك ترين قله‌ها  را داشته باشيم. در مرسوم‌ترين نوع انژكتور، يعني دريچه ي تزريق حلقه ثابت، كسري از نمونه توسط ميكروسرنگ به داخل حلقه ي خارجي يك لوله استيل ضدزنگ وارد مي‌شود و دريچه مي‌چرخد به نحوي كه نمونه با جريان حلال كه در كل سيستم در حال گردش است، به سرعت به داخل ستون وارد شود. حجم نمونه بر اساس اندازه و قطر داخلي حلقه ي نمونه، تعيين مي‌شود لذا براي تغيير حجم نمونه ممكن است نياز به تغيير حلقه‌ها باشد. دريچه‌هاي حلقه ثابت را مي‌توان به دو روش استفاده كرد. در روش حلقه كامل، كه دقيق‌تر است، سرنگي كل حلقه را  با تزريق  نمونه پر مي‌كند. در روش پركردن جزئي، سرنگ، حجم متغيري را به داخل حلقه ي نمونه تزريق مي‌كند؛ دقت حجم تزريق شده توسط سرنگ مشخص مي‌شود. همچنن انژكتورهايي وجود دارند كه مي‌توانند نمونه را به مركز سر ستون (نقطه ي تزريق) وارد كنند. انرژكتورهاي اتوماتيك كنترل شونده با ميكروپرسسور مي‌توانند چند نمونه را به صورت متوالي براي پردازش كلي تزريق كند و براي حداقل كردن تاثيرات تجمعي، به صورت اتوماتيك بين هر دو نمونه، حلقه ي نمونه را با آب پرفشار تميز مي‌كند.

ستون HPLC
ستون‌ها، حاوي فاز ايستا هستند و مهم‌ترين بخش سيستم جداسازي اند. معمولا از استيل ضدزنگ (شماره 316)  ساخته مي‌شوند و مي‌توانند فشارهاي تا psi 10000 را تحمل كننـد. طول آن‌ها بين 10 تا 150 سانتيمتر و قطر داخلي آن‌ها بين 2 تا 5 ميلي متر است. اتصال‌دهنده هايي كه ستون را به ديگر اجزاي سيستم  وصل مي‌كنند و مواد packing را داخل نگه مي‌دارند، بايد حداقل حجم مرده (يعني فاز متحرك باقي مانده در ستون) را داشته باشند و ماكزيمم كارائي (يعني قله‌هاي باريك روي كروماتوگرام) را تضمين كنند.
ستون‌هاي HPLC زماني كه با ذرات متخلخل كوچك (3، 5 يا 10 ميكرومتري) استفاده مي‌شود بسيار كارا  است. براي داشتن ستون‌هاي كارامد و فشارهاي عملكردي مناسب، اندازه ي ذرات بايد تا حد امكان يكنواخت باشد. ذرات با شكل كروي و نامنظم موجود هستند كه ستون‌هاي packed با اين ذرات، عمر طولاني تري داشته و در فشارهاي پائين‌تر عمل مي‌كند.
دو نوع ستون حفاظتي مي‌توانند استفاده شوند: پيش ستون و ستون حائل. پيش ستون كه بين پمپ و دريچه ي تزريق قرار مي‌گيرد با سيليكا packed شده است تا فاز متحرك را با سيليكات اشباع كند. ستون حائل با جمع آوري هر گونه ناخالصي، طول عمر ستون  را زياد مي‌كند و بين انژكتور و ستون تحليلي قرار گرفته است. حجم آن 15/1‌ تا 25/1 برابر‌ حجم ستون تحليلي است و با موادي مشابه با مواد موجود در ستون اصلي packed شده است. گاهي اوقات پيش ستون و ستون حائل به جاي هم به كار مي‌روند.

دتكتور
دتكتور، با تكيه بر تغييرات در خواص عمده ي فاز متحرك و اجزاي نمونه، مانند شاخص انكسار و يا با تكيه بر يك ويژگي مشخص از اجزاي نمونه مانند فلئورسانس، جذب UV يا تغييرات الكتروشيميائي مي‌تواند تركيبات را در حين شسته شدن آن‌ها از ستون، كمي سازي كند. سه نوع دتكتور معمول در آزمايشگاه باليني عبارتند از 1- فتومترها يا اسپكتروفتومترها كه يك طول موج ثابت را ايزوله مي‌كنند (طول موج‌هاي ديگر را مي‌توان با فيلترهاي مناسب انتخاب كرد) يا از منوكروماتورها با طول موج‌هاي مختلف استفاده مي‌كنند؛ 2- دتكتورهاي فلئورسانس كه بر اساس توانائي يك مولكول در ساطع كردن نور بعد از تحريك شدن با تابش هـسـتـنــد و نـسـبــت بــه فـتــومـتــرهــا يــا اسـپـكـتــروفـتــومـتــرهـا حسـاس تـرنـد. 3- دتكتـورهـاي الكتروشيميائي  تركيباتي را كه تحت اكسيداسيون يا كاهش در سطح الكترود قرار مي‌گيرند، ا اندازه گيري مي‌كنند. 
ثبت هر پارامتري كه امكان مانيتور كردن اجزا به صورت تابعي از حجم يا زمان را فراهم مــي‌كـنــد، كــرومــاتــوگــرام نــامـيــده مــي‌شــود. غـلـظــت مــواد حــل شــونــده در يــك سـيـسـتـم كروماتوگرافيك معمولا بر حسب زمان يا فاصله رسم مي‌شود. رزولوشن كروماتوگرام بر‌اساس فاصله ي يك قله ي مجزا از ديگري تعيين مي‌شود، زيرا عواملي كه عرض قله را كنترل مي‌كنند، مسئول رزولوشن هم هستند. مقدار عددي رزولوشن (R) را مي‌توان با معادله‌ي زير تعيين كرد:
 

كه d فاصله ي بين مراكز دو قله، تقسيم بر عرض متوسط پايه (W) ي قله‌ها است (شكل 3 را ببينيد.)

اين محاسبه بر اساس مجموعه اي از شرايط معين شامل فاز متحرك، فاز ايستا و فاز غلظت ماده ي حل شده، است.
براي تضمين سازگاري نمونه و تعيين اين كه آيا كل سيستم دارد درست كار مي‌كند يا نه، از يـك استـانـدارد خـارجـي يـا داخلـي استفـاده مـي‌شـود. يك استاندارد داخلي (كه از نظر ساختاري شبيه به نمونه است اما زمان ماندگاري retention-- متفاوتي دارد)  با غلظت معلوم به نمونه اضافه شده و سپس نمونه به داخل ستون تزريق مي‌شود. زماني كه نتوان از يك استاندارد داخلي استفاده كرد، استاندارد خارجي به صورت جداگانه تزريق مي‌شود.
بــراي حــذف تــاثـيــرات زيــان آور احـتـمــالــي مــايـعــات بـيــولـوژيكـي (مـاننـد پـروتئيـن‌هـا، كربوئيدرات‌ها، ليپيدها) روي انژكتور HPLC، ماده ي packing ستون و پمپ، ممكن است نياز به آماده سازي خاصي از نمونه باشد. به عنوان مثال با افزودن يك اسيد قوي به نمونه، سانتريفيوژ كردن و سرريز كردن مايع روي آن، پروتئين‌ها مي‌توانند رسوب كنند. در روش ديگر كه اولترافيلتراسيون ناميده مي‌شود از يك فيلتر ظريف براي حذف پروتئين استفاده مي‌شود. روش ديگر ايزوله كردن تركيبات از طريق جذب سطحي روي يك رزين تبادل يوني (براي ذرات باردار) يا روي يك ماده ي packing و سپس شستشو است.
اصول مورد استفاده در جداسازي ذرات در كروماتوگرافي ستوني و HPLC مشابه اند. در ادامه برخي از تكنيك‌هاي مختلف HPLC معرفي مي‌شوند:
‌كـروماتوگرافي جذب سطحي: مواد مورد نظر را روي ستون به صورت سطحي جذب مي‌كند و

سپس در حلال دوم، آن‌ها را آزاد مـي‌كنـد. بـا ايـن كـه دو نـوع پـايه، جاذب سطحي وجــود دارنــد -قطبـي و غيـرقطبـي-، جـاذب‌هـاي سطحي قطبي كه در كروماتوگرافي مايع استفاده مي‌شوند (سيليكا و اكسيد الومينيوم) بيش از 95 درصــد از كــاربــردهـاي HPLC و TLC را پـوشـش مي‌دهند. 
‌كـرومـاتـوگرافي فاز تركيبي يا partition: بــر اســاس جـداسـازي مـواد حـل شـده بـر اسـاس تفاوت در توزيع آن‌ها بين دو فاز مخلوط نشدني اسـت. مـاده ي  packing(فـاز ايـسـتـا)، بـا يـك مايع پوشانده مي‌شود. اجزاي نمونه حل پذيري‌هاي مـتـفـاوتـي در ايـن مـايع دارند و ايجاد دو فاز مايع مـي‌كـنـنـد. در كـرومـاتـوگـرافـي مـايع فاز معكوس (RPLC)، دو مايع برعكس مي‌شوند (يعني فاز ايستا ، غـيـرقـطـبـي و فاز متحرك، قطبي است.) اين نوع HPLC بـــه صـــورت گـسـتــرده اسـتـفــاده مــي‌شــود. همچنين مزاياي ديگري هم دارد به عنوان مثال آب كه جزء اصلي فاز متحرك RPLC است ارزان است و اغـلـب جـداسـازي‌هاي RPLC مي‌توانند بدون اسـتـفــاده از حــلال‌هـاي ارگـانـيـك سـمـي يـا قـابـل اشتعال نيز انجام شوند. 
‌كـروماتوگرافي تبادل يوني از فاز ايستاي رزين با بار منفي يا مثبت ثابت استفاده مي‌كند و نمونه و فاز متحرك بر سر مكان‌هاي تبادل يوني رزيــن بــا هــم رقــابــت مــي‌كننـد. ايـن روش بـراي جـداسـازي گـونـه‌هـاي يـونـي مـانـنـد آمـينواسيدها استفاده مي‌شود.
‌كـرومـاتـوگـرافـي نـفوذ ژل، جداسازي بر اســاس انــدازه ي مـلـكــولــي اســت. ســوراخ‌هــا و كــانــال‌هــا در مــاده ي packing زمــان مــانــدگـاري مولكول‌ها را در حين گذر از ستون تعيين مي‌كنند. ابتدا مولكول‌هاي بزرگتر، سپس مولكول‌هاي با اندازه ي متوسط و در انتها كوچكترين مولكول‌هااز ستون شسته مي‌شوند.
برخي از تكنيك‌هاي خاص تحت اين سرفصل در ادامه به صورت كامل‌تري توضيح داده شده‌اند:

كروماتوگرافي ميل تركيبي
كروماتوگرافي ميل تركيبي بر اساس تعامل غيركووالانسي انتخابي بين يك آناليت و مولكول‌هاي خاص

است و اغلب در بيوشيمي براي خالص سازي ارتباطات پروتئين‌ها به بـرچسـب‌هـا (tags) استفـاده مـي‌شود. اين پروتئين‌ها با تركيباتي مانند His-tags، بيوتين (biotin) يا آنتي ژن‌ها كه به صورت خاص با فاز ايستا تركيب مي‌شوند، برچسب گذاري مي‌شوند. بعد از خالص سازي، برخي از اين tagها معمولا حذف شده و پروتئين خالص به دست مي‌آيد.  ‌در كروماتوگرافي ميل تركيبي، اغلب از ميل تركيبي بيوملكول براي يك فلزZn (، Cu،  Fe و غيره) استفاده مي‌شود. ستون‌ها اغلب به صورت دستي آماده مي‌شوند. ستـون‌هـاي سنتـي ميـل تـركيبـي بـه عنـوان گـام مقـدماتي براي شستشوي بيوملكول‌هاي ناخواسته استفاده مي‌شوند.
با اين حال برخي از تكنيك‌هاي HPLC از خواص كروماتوگرافي ميل تركيبي استفاده مي‌كنند. كروماتوگرافي Immobilized Metal Affinity يا IMAC براي جداسازي مولكول‌هاي مذكور بر اساس ميل تركيبي نسبي براي فلز (يعني Dionex IMAC) مفيد است. اغلب اين  ستـون‌هـا را مـي‌تـوان بـا فلزهاي مختلف براي ايجاد يك ستون با ميل تركيبي موردنظر بارگذاري كرد.

كروماتوگرافي مايع supercritical
اين نوع كروماتوگرافي، يك تكنيك جداسازي است كه در آن فاز متحرك، مايعي در دما و فشار بالا و نسبتا نزديك به فشار و دماي بحراني آن است.

تكنيك‌هايي با مكانيزم جداسازي كروماتوگرافي تبادل يوني
كروماتوگرافي تبادل يوني (كه معمولا به عنوان كروماتوگرافي يوني ناميده مي‌شود) از مكانيزم تبادل يوني براي جداسازي آناليت‌ها بر‌اساس بار نسبي آن‌ها استفاده مي‌كند. اين نوع كروماتوگرافي معمولا در ستون‌ها انجام مي‌شود، اما در مود صفحه اي نيز مي‌تواند مفيد باشد. كروماتوگرافي تبديل يوني از يك فاز ايستاي باردار براي جداسازي تركيبات باردار  شامل آنيون‌ها، كاتيون‌ها، آمينواسيدها، پپتيدها و پروتئين‌ها استفاده مي‌كند. در روش‌هاي مرسوم، فاز ايستا يك رزين تبادل يوني است كه گروه‌هاي عملكردي باردار را حمل مي‌كند كه براي حفظ شدن، با گروه‌هاي با بار مخالف تركيب واكنش مي‌دهند. كـرومـاتـوگـرافـي تبـادل يوني معمولا براي خالص سازي پروتئين‌ها با استفاده از FPLC استفاده مي‌شود. 

كروماتوگرافي size-exclusion
ايــن نــوع كـرومـاتـوگـرافـي (SEC) همچنيـن بـه عــنـــوان كـــرومـــاتــوگــرافــي نـشــت ژلــي (GPC)

يــا كروماتوگرافي فيلتراسيون ژل ناميده مي‌شود و مولكول‌ها را بر اساس اندازه ي آن‌ها (يا به بيان صـحـيـح تـر طـبـق قـطـر هـيـدروديـنـامـيـك يا حجم هـــيــــــدروديـــنـــــامـــيـــــك آن‌هـــــا) جـــــدا مـــــي‌ســـــازد. مــولـكــول‌هـاي كـوچـك‌تـر قـادر هستنـد كـه وارد سوراخ‌هاي محيط شده و بنابراين گير افتاده و از جـــريـــان فـــاز مــتـحــرك خــارج مــي‌شــونــد. زمــان مــانــدگــاري مـتــوســط در ســوراخ‌هــا، وابـسـتــه بـه انـدازه‌ي مـوثر مولكول‌هاي آناليت است. با اين حال مولكول‌هايي كه بزرگ‌تر از اندازه ي متوسط منافذ  packing هستند حذف شده و بنابراين اساسا اجازه  هيچ ماندگاري اي را نمي دهد؛ اين گونه‌ها در ابتدا شسته مي‌شوند. اين نوع كروماتوگرافي، رزولوشن پائين دارد و بنابراين اغلب به عنوان گام نهـائي پردازش در خالص سازي  در نظر گرفته مـي‌شـود. همچنيـن بـراي تعييـن سـاختـار سـوم و چـهـارم پـروتئين‌هاي خالص شده مفيد است به ويژه اين كه  مي‌تواند تحت شرايط محلول native انجام شود.

جداسازي كروماتوگرافيك
 (EBA (Expanded Bed Adsorption 
جداسازي كروماتوگرافيك EBA يك پروتئين هدف را از جريان ورودي خام در هنگام عبور آن از سـيـسـتـم سـتوني كروماتوگرافي حاوي دانه‌هاي جـاذب اخـذ مـي‌كـنـد. بـا ايـن تكنيك مي‌توان در سـتـون كروماتوگرافيك مستقيما با مواد اوليه ي خام، كار كرد؛ بدون اين كه نياز به گام‌هاي پيش عـــمـــلـــيــــــات و تـــصـــفـــيــــــه بــــــاشـــــد. جـــــداســـــازي كروماتوگرافيك EBA بسيار مقياس پذير است، از ستـون‌هـاي آزمـايشگاهي با قطر يك سانتيمتر تا ستون‌هاي بزرگ توليد تا قطر دو متر. اين ستون‌ها مي‌توانند با مواد اوليه ي بيش از يك ميليون ليتر در هر روز يا با ظرفيت توليد MT‌1000  پروتئين در هر سال، كار كنند.

تكنيك‌هاي خاص كروماتوگرافي فاز معكوس
كـــرومـــاتـــوگـــرافـــي فــاز مـعـكــوس يــك روش شستشو است كه در كروماتوگرافي مايع استفاده مي‌شود و در آن فاز متحرك به ميزان قابل توجهي قطبي تر از فاز ايستا است.

كروماتوگرافي دو بعدي
در برخي موارد، خواص شيميائي داخل يك سـتـــون مـمـكـــن اســت بــراي جــداســازي بــرخــي آناليت‌ها ناكافي باشد. مي‌توان يك سري قله‌هاي تجزيه نشده را به ستون دومي كه خواص فيزيكي- شيميائي متفاوتي (كلاس شيميائي) دارد، هدايت نـمـود. از آنجـا كـه مكـانيـزم مـانـدگـاري روي ايـن پـشـتـيـبـان جـامـد جـديـد، مـتفاوت است، مي‌توان تركيباتي كه توسط كروماتوگرافي يك بعدي قابل جداسازي نبودند، را از هم جدا كرد. نمونه در يك گوشه ي يك صفحه ي مربعي به صورت دقيق جاگذاري شده، گسترش داده مي‌شود، سپس با هوا خشك شده و به اندازه ي 90 درجه چرخانده مـي‌شـود و مـعـمـولا در يـك سـيستم حلال ديگر تجزيه مي‌شود.

كروماتوگرافي گاز تفكافت (يا تجزيه در اثر حرارت، تفكافت)
اسـپـكـتــرومـتــري جـرمـي كـرومـاتـوگـرافـي گـاز تفكافت، يك روش تحليل شيميائي است كه در آن نـمــونــه بــراي تـجــزيــه شـدن، گـرم مـي‌شـود تـا مــولـكــول‌هــاي كــوچــك‌تــري تـولـيـد شـود كـه بـا كروماتوگرافي گاز از هم تفكيك شده و با استفاده از اسپكترومتري جرمي تشخيص داده مي‌شوند.
تفكافت، تجزيه ي مواد با استفاده از حرارت در اتمسفـر بـي اثـر يـا در خـلا اسـت. نمونه در تماس مستقيم با سيم پلاتيني يا در يك لوله ي نمونه ي كوارتز قرار داده مي‌شود و سريعا تا 600 الي 1000 درجه ي سانتيگراد گرم مي‌شود. بسته به كاربرد حتي ممكن است از دماهاي بالاتر استفاده شود. سه تـكـنـيــك گــرم كــردن مـخـتـلــف در pyrolyzerهــاي واقعي استفاده مي‌شود: كوره‌ي همدما، گرم كردن القائي و گرم كردن مقاومتي با استفاده از فيلمان‌هاي پلاتين. مولكول‌هاي بزرگ از ضعيف ترين نقاط خود مي‌شكنند و قطعات كوچك‌تر و فرارتر ايجاد مي‌كنند. اين قطعات را مي‌توان با كروماتوگرافي گاز تفكيك كرد. كروماتوگرام‌هاي تفكافت GC به صـورت نـوعي پيچيده اند؛ زيرا بازه‌ي وسيعي از محصولات تجزيه ي مختلف تشكيل مي‌شوند. داده مي‌تواند به عنوان اثر انگشت براي شناسائي هــويــت مــواد اسـتـفــاده شـود يـا داده  GC/MS بـراي شـنــاســائــي قـطـعــات مـجــزا بـراي بـه دسـت آوردن اطلاعات ساختاري استفاده مي‌شود.
در كنار استفاده از pyrolyzerهاي اختصاصي ، تفكافت  GC از نمونه‌هاي مايع و جامد را مي‌توان مستقيما داخل انژكتورهاي PTV انجام داد كه مي‌توانند نمونه را به سرعت (تا 30 درجه ي سانتيگراد بر ثانيه) و تا دماهاي بيشينه ي بالا حدود 600 تا 650 درجه سانتيگراد گرم كنند كه براي برخي از كاربردهاي تفكافت كافي است. مزيت اصلي اين است كه نياز به خريداري هيچ دستگاه اختصاصي نيست و تفكافت مي‌تواند به عنوان بخشي از روتين آناليز GC انجام شود. 

كروماتوگرافي مايع پروتئين سريع
FPLC عبارتي است كه براي چند تكنيك كروماتوگرافي براي خالص سازي پروتئين‌ها استفـاده مـي‌شـود. بسيـاري از اين تكنيك‌ها مشابه آن‌هائي هستندكه تحت HPLC انجام مي‌شوند با اين حال استفاده از تكنيك‌هاي FPLC معمولا براي آماده سازي batch هائي از محصول خالص سازي شده در مقياس بزرگ هستند. 

كروماتوگرافي جريان مخالف (countercurrent)
CCC يك نوع كروماتوگرافي مايع-مايع است كه درآن هر دو فاز متحرك و ايستا مايع هستند. اصل عملكردي دستگاه CCC نياز به يك ستون متشكل از يك لوله ي باز پيچيده شده دور يــك بــوبـيــن (bobbin) دارنــد. بــوبـيـن بـا حـركـت گـردنـده ي دو محـوري (cardioids) مي‌چرخد. اين حركت باعث مي‌شود ستون در هر چرخش يك گام جزء‌بندي را ببيند و اجزاي نمونه در ستون به خاطر ضريب جزء بندي شان بين دو فاز مايع مخلوط نشدني مورد اســتــفــــاده تــفــكــيـــك شـــونـــد. انـــواع زيـــادي CCC امـــروزه مـــوجـــود هــســتــنـــد كـــه شـــامـــل HSCCC CCC() سرعت بالا و (HPCCC CCC) با كارائي بالا) هستند. HPCCC جديدترين و كاراترين نسحه ي دستگاه در حال حاضر است. 

كروماتوگرافي كايرال
كروماتوگرافي كايرال شامل جداسازي ايزومرهاي فضائي (stereoisomers) است. در مورد آنانتيومرها (enantiomers)، اين‌ها هيچ تفاوت شيميائي يا فيزيكي جز اين كه تصاوير آيـنــه‌اي سـه بعـدي انـد نـدارنـد. كـرومـاتـوگـرافـي مـرسـوم يـا ديگـر فـراينـدهـاي جـداسـازي نمي‌توانندآن‌ها را تفكيك كنند. براي ممكن ساختن تفكيك كايرال يا فاز متحرك يا فاز ايستا بايد خودشان كايرال شوند و ميل‌هاي تركيبي متفاوت بين آناليت‌ها بدهند. ستون‌هاي HPLC كروماتوگرافي كايرال (با فاز ايستاي كايرال)  هم فاز طبيعي و هم فاز معكوس به صورت تجاري موجود هستند.

مشكلات گزارش شده
آماده سازي نمونه‌ها تاثير زيادي روي كيفيت آناليز دارد. مسائلي مانند عوامل تداخلي در نمونه يا تغيير در pH كه هر دو از آماده سازي اسيدي ناشي مي‌شوند؛ عوامل تداخلي حذف نـشـده تـوسـط اولـتـرافـيـلـتـراسـيـون؛ و تـركـيـب پـروتئيني بيش از حد. راهكارهاي مختلف استانداردسازي نيز مي‌توانند ايجاد مشكل كنند: استانداردسازي خارجي مي‌تواند منجر به از دسـت رفـتـن مـتـغـيـر در طـول آمـاده سـازي و نـيـز تـزريـق مـتـغـير نمونه شود. در مقايسه استانداردسازي داخلي مي‌تواند دقت را محدود كند؛ چرا كه اندازه گيري صحيح دو قله، مشكل است.
مشكلات مرسوم در سيستم‌هاي HPLC، خطوط پايه ي نويزي و دريفت در  خط پايه است. نرخ كند جريان يا سيستم گراديان خطادار مي‌تواند منجر به افزايش زمان ماندگاري نمونه شود. بارگذاري بيش از حد ستون با نمونه يا تخريب packing ستون مي‌توان رزولوشن آن را كاهش دهد.
پمپ‌ها براي حداقل كردن پالس طراحي شده اند. به هر حال با هيچ روشي نمي توان پالس‌ها را به طور كامل حذف كرد. اين امر به ويژه در مورد دتكتورهاي الكتروشيميايي كه نسبت به انواع ديگر دتكتورها حساسيت بيشتري نسبت به پالس دارند، برقرار است. 
زماني كه از دريچه‌هاي حلقه ثابت (روش حلقه ي كامل) استفاده مي‌شود، آلودگي ناشي از نمونه‌هاي قبلي مي‌تواند منجر به توليد نتايج غيرصحيح شود. حلقه بايد قبل از بارگذاري، با 5 تا 10 برابر حجم حلقه شسته شود.

توصيه‌هاي لازم
سيستم HPLC متشكل از مدول‌هاي مختلف است كه خريداران مي‌توانند از بين آن‌ها بر‌اساس نيازهاي خود انتخاب كنند. به عنوان مثال، اگر تنها تعداد كمي نمونه به صورت روزانه آناليز مي‌شود، ممكن است انژكتور دستي كافي باشد. به علاوه دتكتورهاي متفاوتي براي آناليت‌هاي بيولوژيكي مختلف، مناسب اند. اغلب توليدكنندگان سيستم را براي خريدار به صورت سفارشي تنظيم مي‌كنند.
ممكن است در برخي كاربردهاي باليني، نياز باشد كه اين دستگاه‌ها تاييديه ي FDA براي كاربردهاي in vitro داشته باشند. توليدكنندگاني كه دستگاه‌هايشان اين كاربردها را دارند مي‌توانند مدارك مربوطه را در اختيار كاربران قرار دهند.
قبـل از خـريـد سيستـم HPLC خـريـداران بـايـد تعيين كنند كه آيا سازنده سيستم، تمام ستون‌هاي جايگزين و تداركات موردنياز را مي‌فروشد. اگر سازنده اين آيتم‌ها را نفروشد خـريـدار بـايـد بداند كه چه انواعي با دستگاه اين توليدكننده سازگارند و از كجا بايد آن‌ها را تامين كند. برخي از تامين كنندگان، در صورت خريد عمده، تخفيف قابل توجهي در مورد معرف‌ها و ديگر تداركات ارائه مي‌كنند.
مـواد مصـرفـي بخـش عمـده اي از هـزينـه‌هاي عـمـلـكــردي را تـشـكـيــل مــي‌دهـنــد و ايــن هــزيـنـه مـي‌تـواند بسته به تخفيف‌هاي ارائه شده توسط تامين كننده، تا حد زيادي تغيير كند. 
يك مساله ي مهم در مورد سيستم‌هاي HPLC، ارتباط آن‌ها با كامپيوتر است. برقراري يك ارتباط مـوثـر بـا سـيـسـتم اطلاعات آزمايشگاهي (LIS) يا سـيـسـتــم كــامـيـپــوتـري مـركـزي بـراي وارد كـردن داده‌هاي تست، ارزيابي صحت تست،  حفظ QC، كاليبره كردن، تست‌هاي كارائي و فايل‌هاي بيمار طبق رهنمودهاي CLIA ضروري است.

هزينه ها
قيمت خريد يك سيستم HPLC هزينه ي كلي مـالكيـت دستگـاه را بـه صورت صحيح منعكس نمي كند. هزينه‌هاي نگهداري و عملكرد مداوم دستگـاه نيز جزو هزينه‌هاي مالكيت دستگاه در طول عمر آن هستند. هزينه‌هاي ديگري كه بايد در نظر گرفته شوند عبارتند از:
‌ارتـقــاي نــرم افــزاري كــه در گــارانـتـي يـا در قرارداد خدمات در نظر گرفته نشده اند. 

منبع: نشریه مهندسی پزشکی شماره ۱۴۷، مهندس فاطمه یاوری