پزشکی بالینی

دسته بندي ماشيني سلولهاي خوني

تحليل‌گرهاي هماتولوژي(سل كانترها) شمارش تام وافتراقي سلولهاي خوني را براساس ويژگي‌هايي نظيراندازه وحجم سلولي، ميزان تراكم هسته، خواص بيوشيميايي سيتوپلاسم، رسانايي سلول، وضعيت گرانولها و پراكنش نورتابشي توسط سلول انجام مي‌دهد.

 به‌طور كلي اين دستگاهها به دو روش عمده عمل مي‌كند:
1) تغيير درهدايت الكتريكي كه خودشامل روشهاي امپدانس الكتريكي و كاپاسيتانس الكتريكي است و‏
‏2) روشهاي اپتيكال يا نوري (واكنشهاي سيتوشيميايي و پراكنش نور).
روشهاي اپتيكال (نوري) برواكنش متقابل نور و ماده استوار است‎؛ هنگامي كه يك پرتو نوري به جسم خاصي مثل يك سلول خوني برخورد مي‌كند سه حالت ممكن است براي آن اتفاق افتد:‏
‏1) تغييرجهت داده و پراكنده شود،
‏2)جذب ماده شده و به گرما تبديل شود و ‏
‏3)جذب ماده شده و سپس با طول موج متفاوتي بازتابش گردد (فلوئورسانس).
تحليل‌گرهاي هماتولوژي ممكن است برخي از اين حالات  يا تمامي آنها را مورد استفاده قرار دهد. سيستمهاي تكنيكون سري‏H‏ كه موضوع بحث مقاله حاضراست در شمارش تام و افتراقي سلولهاي خوني از خصلت‌هاي پراكنش نور (حالت اول) و جذب نور (حالت دوم) استفاده مي‌كند. در اين دستگاهها جهت تحليل نمونه‌هاي خوني، چهار كانال تعبيه شده است كه عبارت است از: 1) كانال اريتروسيت ‏‎-‎‏ پلاكت 2) كانال هموگلوبين 3) كانال پروكس 4) كانال بازوفيل- لوبولاريتي (كانال دانسيته هسته‌اي). دركانال هموگلوبين، با استفاده از كالريميتر دستگاه ميزان هموگلوبين نمونه سنجش مي‌شود. در كانال اريتروسيت-پلاكت، سلولهاي خوني با قرار گرفتن در يك جريان سلولي (‏Flow cell‏) مورد اصابت پرتو ليزر قرار مي‌گيرد. ميزان تفرق اين پرتو (توسط سلولها) دردو زاويه بسته و باز كه به ترتيب بيانگر ميزان حجم (اندازه) و دانسيته سلولها (غلظت هموگلوبين) است (شكل 1)، توسط آشكارسازهاي دستگاه سنجش مي‌شود. بدين ترتيب اطلاعات حاصل از پراكنش‌هاي دوگانه فوق توسط رايانه دستگاه به سيتوگرامها و هيستوگرامهايي تبديل شده و در نهايت شمارش اين سلولها و انديس‌هاي آنها اندازه‌گيري و محاسبه مي‌شود. و اما ازآنجا كه اطلاعات حاصل ازدوكانال پروكس و بازوفيل-لوبولاريتي در شمارش و ارزيابي لكوسيتهاي خون به كار مي‌رود به طور مفصل‌تري به شرح اين دو كانال پرداخته مي‌شود.‏
همان‌گونه كه در ابتدا نيز ذكر شد اساس كار اين دستگاهها بر واكنشهاي سيتوشيميايي سلول و پراكنش نور استوار است. در كانال پروكس، با استفاده از خاصيت پراكسيداز سلولهاي سفيد خوني، شمارش افتراقي آنها امكان‌پذير مي‌شود. به همين منظور در اين كانال نخست نمونه خون با يك معرف رقيق‌كننده حاوي ‏SDS‏ (كه اريتروسيتها را تخريب مي‌كند) و مخلوطي از فرمالدئيد و سوربيتول (كه باعث هيپرتونيك شدن محلول و درنتيجه دهيدراته و فيكس شدن لكوسيتها مي‌شود) مخلوط مي‌شود. سپس به اين سوسپانسيون معرف ديگري كه حاوي سوبستراي4)كلرو1)نفتول همراه با آب اكسيژنه است اضافه مي‌شود. چنانچه گرانولهاي لكوسيتها داري خاصيت پراكسيداز باشد، با شكستن آب اكسيژنه و آزادسازي راديكال اكسيژن، ماده كروموژن (كلرونفتل) به صورت رسوب خاكستري تا سياه درمحلهاي با خاصيت پراكسيداز ظاهر مي‌شود. شدت رنگ پذيري بستگي به ميزان فعاليت پراكسيداز دارد. جهت ارزيابي حاصل واكنش پراكسيداز، سلولها در يك جريان باريك از سيتومتري كه درمعرض تابش نورتنگستن است عبورمي‌كند. به علت جريان باريك، سلولها به صورت تك تك عبوركرده و پرتو تابشي به هر سلول جداگانه در ضمن عبور برخورد مي‌كند. هر سلول براساس حجمي كه دارد ميزاني ازاين نور را پراكنده مي‌سازد. در طرف مقابل نور تابشي دو آشكارساز تعبيه شده كه يكي از آنها به نور پراكنده شده حساس است (آشكارساز زمينه تاريك) و ديگري به نور جذب شده توسط سلول حساس است (آشكارساز زمينه روشن). بنابراين هر سلول در آن واحد به دو شكل مورد بررسي قرار مي‌گيرد: يكي ميزان پراكنش نور كه متناسب با اندازه سلول است و ديگري ميزان جذب نور كه متناسب با شدت رنگ پذيري سلول (ميزان پراكسيداز سلول) است. حال چنانچه ميزان جذب نوري روي محور افقي مختصات (‏X‏) و ميزان پراكنش نور روي محور عمودي مختصات (‏Y‏) برده شود، هر سلول مانند يك نقطه داراي مختصات ‏X‏ و ‏Y‏ بوده و جايگاه خود را در صفحه پيدا مي‌كند. سلولهايي كه داراي مختصات يكسان (پراكنش و جذب نوري يكسان ) باشد، در صفحه ايجاد تجمع يا خوشه (‏Cluster‏) واحدي مي‌كند. اين تجمع‌ها توسط آستانه‌هايي (‏Threshold‏) از انواع ديگر متمايز مي‌شود. تعداد سلولهاي هر تجمع توسط رايانه دستگاه شمارش شده و از مجموع آنها شمارش تام لكوسيتي حاصل مي‌شود. براساس اطلاعات حاصل از كانال پروكس، لكوسيتهاي خون به شش دسته مجزا تقسيم مي‌شود.
- ائوزينوفيل‌ها و نوتروفيل‌ها كه داراي بيشترين مقدار پراكسيداز بوده و در سمت راست سيتوگرام قرار مي‌گيرد.
- منوسيت‌ها كه داراي پراكسيداز ضعيفي بوده و در وسط سيتوگرام قرار مي‌گيرد.
- لنفوسيت‌ها، بازوفيل‌ها و ‏LUCها (سلولهاي بزرگ رنگ نشده) كه فاقد فعاليت پراكسيداز است و در سمت چپ سيتوگرام واقع مي‌شود (شكل 2). ‏
در كانال بازوفيل ـ لوبولاريتي (‏Baso‏) كه به آن كانال دانسيته هسته‌اي نيز گفته مي‌شود، از خاصيت مقاومت بازوفيل‌ها نسبت به اثر ليزكننده‌گي معرف ليزكننده در ‏pH‏ اسيدي استفاده مي‌شود. بنابراين در‏pH‏ اسيدي و در حضور يك معرف ليزكننده حاوي سورفكتانت و اسيدفتاليك، سيتوپلاسم و غشا‌‌‍ء سلولي نوتروفيل‌ها، ائوزينوفيل‌ها، لنفوسيت‌ها و منوسيت‌ها حذف شده هسته آنها عريان مي‌شود ولي سلولهاي بازوفيل بصورت دست نخورده باقي مي‌ماند. در اين كانال سوسپانسيون سلولي حاصل به صورت جرياني تك رديفي از سلولها از مقابل پرتو ليزر عبور كرده و ميزان پراكندگي نور در دو زاويه بسته ياS2 ‎‏ (زاويه ‏‎0-5‎‏ درجه) و بازتر يا‏‎ S1 ‎‏( زاويه ‏‎5-15‎‏ درجه) اندازه‌گيري مي‌شود. زاويه بسته، اندازه سلول (حجم سلولي) و زاويه باز ميزان لوبولاريته و تراكم هسته سلول را اندازه‌گيري مي‌كند. در واقع لوبولاريته هسته سلولها در سيتوگرام ايجاد شكلي شبيه نوزاد قورباغه مي‌كند كه سر آن در قسمت  ‏MN‏ و دم آن در قسمت ‏PMN‏ واقع مي شود (شكل 3) .گفتني است كه سلولهاي بلاست به دليل تراكم هسته‌اي پاييني كه دارند در منتهي‌اليه سمت چپ (سمت چپ سلولهاي تك هسته اي (‏MN‏) طبيعي) قرار مي‌گيرد. همچنين گلبولهاي قرمز هسته‌دار (‏NRBC‏) به دليل تراكم هسته‌اي بسيار بالايي كه دارد در سمت راست ‏PMN‏ ها قرار مي‌گيرد. در حقيقت ترتيب قرارگرفتن سلولها در كانال تراكم هسته‌اي از چپ به راست به ترتيب زير است: ‏
NRBC‏ ‏‎?‎‏ نوتروفيل‎?‎‏ ائوزينوفيل ‏‎?‎‏ سلول باند ‏‎?‎‏ گرانولوسيتهاي نارس ‏‎?‎‏ منوسيت ‏‎?‎‏ لنفوسيت ‏‎?‎‏ بلاست
حال به شرح يك سيستم ابتكاري به نام "پاندا" كه توسط برخي محققان جهت طبقه‌بندي بدخيمي‌هاي هماتوپوئيتيك ارائه شده است، پرداخته مي‌شود.‏
تشخيص لوسمي‌ها روندي پيچيده بوده ونيل به آن مطالعات گوناگوني نظير ارزيابيهاي مورفولوژيك، سيتوشيميايي، سيتوژنتيك، ايمونوفنوتايپينگ، بيولوژي مولكولي و‎...‎‏ را به همراه ارزيابي‌هاي باليني مي‌طلبد. بررسي مورفولوژيكي (ميكروسكوپي) سلولهاي خوني اطلاعاتي راجع به هسته و سيتوپلاسم سلولهاي بدخيم را فراهم مي‌سازد كه در تشخيص انواع لوسمي‌ها اساسي است. علاوه بر اين مي‌توان از تحليل‌گرهاي هماتولوژي (سل‌كانترها) به عنوان ابزارهاي غربالگري اوليه نيز كمك گرفت. در اين مورد تحليل‌گرهايي كه برمبناي فلوسيتومتري و سيستم پراكنش نور عمل مي‌كند (به ويژه آنهايي كه روشهاي سيتوشيميايي را نيز به خدمت گرفته‌اند)، كارآمدتر از سيستمهاي امپدانسي است. تحليل‌گرهاي تكنيكون سري ‏H‏ در اين ميان جايگاه ويژه‌اي را به خود اختصاص داده‌ است. اين دستگاه‌ها با بهره‌گيري همزمان از كانالهاي پروكس و دانسيته هسته‌اي اطلاعات با ارزشي را فراهم مي‌سازد كه درك كامل آن امكان ايجاد يك ارتباط منطقي بين جمعيت‌هاي غيرطبيعي سلولي در سيتوگرام‌هاي اين دستگاه‌ها با نماي واقعي مورفولوژيك اين سلولها (طبقه بندي ‏FAB‏ و‏WHO‏ ) را در پي‌دارد.
پاندا (‏PANDA‏) اصطلاحي اختصاري است كه از تركيب ‏PA‏ (فعاليت پراكسيدازي) و‏‎ ND‎‏ (تراكم هسته‌اي) به وجود آمده است. بنابراين روش مذكور يعني ‏‎ Peroxidase Activity and Nuclear Density Analysis‎‏ مي‌تواند‎ ‎ويژگي لكوسيت‌ها و نيز دسته‌بندي لوسمي‌ها را فراهم آورد. يك مرحله اساسي در دسته‌بندي لوسمي‌ها، افتراق ميلوئيد يا لنفوئيد بودن آنها است كه آنزيم پراكسيداز در نيل به اين هدف اهميت بسزايي دارد. گام بعدي شامل تشخيص حاد  يا مزمن بودن اين اختلالات است كه اين مهم نيز از طريق ارزيابي تراكم هسته‌اي سلولها در كانال بازوفيل‎- ‎لوبولاريتي تحقق مي‌يابد. در لوسمي‌هاي حاد سلولهاي بلاست ـ كه حاوي هسته نارس با دانسيته كم است - حضور دارد درحالي‌كه در لوسمي‌هاي مزمن بلوغ سلولها بيشتر بوده و در غالب مواقع هسته اين سلولها رسيده‌تر (داراي تراكم بيشتر) است. براساس اطلاعات حاصل از سيتوگرام دانسيته هسته‌اي مي‌توان لكوسيتها را در سه دسته ‏D0‎، ‏‎ D1‎و ‏D2‎‏ جاي داد.
الگوي ‏D0‎‏ بيانگر حالتي است كه تجمع سلولهاي تك‌هسته‌اي (‏MN‏)، طبيعي است. به‌طور معمول در لوسمي‌هاي مزمن، جمعيت سلولهاي لوسميك داراي چنين الگويي است (شكل 4). غالباً در الگوي ‏D0‎، علامت هشدار (‏Flag‏) بلاست منفي بوده و اين حالت در مواردي چون ‏CLL، ‏CML، لنفوسيتوز آتيپيك ويروسي، كمبود ميلوپراكسيداز، نوتروفيل‌هاي بيماران ايدزي و به ندرت در حالت ‏ALL‏ ديده مي‌شود.
در حالت ‏D1‎‏ جابجايي الگوي ‏ND‏ (سيتوگرام دانسيته هسته‌اي) به سمت پايين و چپ جايگاه اصلي ديده مي‌شود، به‌گونه‌اي كه جمعيت ‏MN‏ ها به يك شكل مدور مشاهده مي‌شود. الگوي ‏D1‎‏ نشان دهنده حضور لكوسيت‌هايي با هسته نارس  يا كروماتين بسيار شل است و توجه را به سمت يك لوسمي حاد (ميلوئيد يا لنفوئيد) جلب مي‌كند. اين الگو به هنگام حضور سلولهاي بلاست در خون محيطي ديده مي‌شود وغالب‍اً سيتوگرام ‏ND‏ در اين الگو داراي هشدار بلاست است (شكل 5). الگوي ‏D1‎‏ در مواردي نظير ‏ALL، ‏‎ AML‎و كريزبلاستي ‏CML‏ ديده مي‌شود.
درحالت ‏D2‎‏ جابجايي الگوي ‏ND‏ به سمت بالاي جايگاه اصلي ‏MN‏ در سيتوگرام ديده مي‌شود كه نشان دهنده لنفوسيتوز آتيپيك ويروسي به ويژه مونونوكلئوز عفوني است. چنين الگويي نشان دهنده حضور سلولهاي بزرگي با الگوي كروماتين هتروژن است و غالباً در اين حالت هشدار بلاست منفي است (شكل 6).
سيتوگرام حاصل از كانال پروكس در تشخيص ميلوئيد يا لنفوئيد بودن جمعيت سلولي لكوسيتها نقش اساسي دارد. الگوهاي به دست آمده از سيتوگرام اين كانال (‏PA‏) هتروژن بوده و بر مبناي فعاليت پراكسيدازي سلولها، حداقل 7 دسته سلولي جهت تشخيص مرحله تمايزي سلولهاي لوسميك ارائه شده است. اين الگو داراي دامنه ‏‎ P0‎‏(فقدان فعاليت پراكسيداز) تا ‏P6‎‏ (بيشترين سطح فعاليت پراكسيداز ) است (شكل 7).
الگوي ‏P0‎‏ در حالت فقدان فعاليت پراكسيداز ديده مي‌شود و نشان‌دهنده نبودن تمايز ميلوئيدي است. اين الگو در مواردي نظير ‏ALL (L1- L3)‎، ‏CLL، ‏NHL‏ (لنفوم غيرهوچگين)، لنفوسيتوز آتيپيك، فقدان كامل ميلوپراكسيداز و زيرگروه‌هاي ‏M0‎، ‏M5a،M6 ‎‏ و‏M7‎‏ در ‏AML‏ ديده مي‌شود (شكل 8).
الگوي ‏‎ P1‎پراكنشي را در قسمت بالاي جايگاه اصلي تجمع سلولها (ميانه سيتوگرام) نشان مي‌دهد كه بيانگر حضور تعداد اندكي از سلولهاي با فعاليت پراكسيداز به همراه تمايز اوليه  يا نسبي ميلوئيد است. اين الگو در زيرگروه‌هاي ‏M1‎، ‏M2‎، ‏M5a‏ و ‏M5b‏ از ‏AML‏ ديده مي‌شود (شكل 9).
در الگوي ‏P2‎‏ تجمع كم و بيش يكنواختي از سلولها در ناحيه ‏LUC‏ وجود دارد كه به‌طرف ناحيه منوسيتي و اوايل ناحيه نوتروفيلي پراكنده شده‌ است (شكل 10). اين الگو در مواردي نظير ‏M1‎، ‏M2‎،M4 ‎، ‏M5a‏ و ‏M5b‏ ديده مي‌شود. ‏
در حالت ‏P3‎‏ يك فعاليت پراكسيداز متوسط تا شديد به همراه سلولهاي با اندازه يك‌دست ديده مي‌شود (شكل 9). اين الگو در زيرگروه‌هاي ‏M2‎‏ و ‏M4‎‏ از‏AML‏ ديده مي‌شود. سيتوگرام پروكس در الگويP4 ‎‏ داراي يك فعاليت قوي ولي هتروژن پراكسيداز بوده و در حالت‌هايي نظير ‏CML‏ و زيرگروه‌هاي ‏M2‎‏ و ‏M4‎‏ ديده مي‌شود (شكل 11).
الگوي ‏P5‎‏ سلولهاي بسيار بزرگي را نشان مي‌دهد كه داراي فعاليت پراكسيداز زيادي است (شكل 12 ). اين الگو نشان دهنده مواردي نظير نوتروفيل‌هاي افراد مبتلا به ايدز، ‏MDS،CML ‎‏ و زيرگروه ‏M3v‏ از ‏AML‏ است و بالاخره الگوي ‏P6‎‏ نشان دهنده فعاليت پراكسيدازي بسيار شديد است كه در زيرگروه‎ M3 ‎از ‏AML‏ مشاهده مي‌شود (شكل 13 ).
با به‌كارگيري همزمان سيستم‌هاي امتيازي ‏PA‏ و ‏ND‏ مي‌توان جدول ساده اي را طراحي نمود كه در دسته‌بندي لوسمي‌ها كمك‌كننده خواهد بود (جدول 1). تجربه‌هايي كه طي سالهاي گذشته از بررسي سيتوگرامهاي ‏H3‎‏ بدست آمده است نشان مي‌دهد كه بدون بررسي‌هاي بيشتر، استفاده از الگوهاي سيتوگرامهاي مذكور در دسته‌بندي انواع گوناگون لوسمي‌ها داراي صحت و كارايي نسبتاً خوبي بوده است. در جدول (2) تعداد موارد بررسي شده به همراه تعداد تشخيص‌هاي صحيح و نيز كارايي حاصل از اين سيتوگرامها در تشخيص انواع اختلالات هماتوپوئيتيك ارائه شده است . به هر حال روش ابتكاري پاندا را نمي‌توان به تنهايي در تشخيص لوسمي‌ها بكار گرفت ولي مي‌توان از اطلاعات حاصل از آن پيش از مطالعه ميكروسكوپي نمونه‌ها  يا در انتخاب ‏CDهاي مناسب جهت آزمونهاي ايمونوفنوتايپينگ استفاده شايان نمود. سيستم عددي پاندا را مي‌توان به آساني جهت رايانه تحليل‌گرها سازگارنمود. نتيجه آنكه با روش ابتكاري پاندا و با درك كامل از اساس آن مي‌توان اطلاعات با ارزشي را از سيتوگرامهايي كه در كمتر از يك دقيقه از يك نمونه خون حاوي ‏EDTA‏ حاصل مي‌شود، به‌دست آورد.‏

منابع:

  1) ملكي، علي: اصول كار و منابع خطا در آناليزرهاي هماتولوژي (سل كانترها). تهران، انتشارات انديشه رفيع، 1384.

‏‎2.Robert I.Handin: Blood; Principle and Practice of Hematology. Philadelphia J.B.Lippincott, 1th ed (1995
3.Elkin Simson, Dennis W. Ross, William D. Kocher: Atlas of Automated Cytochemical Hematology. Technicon Instrument Corporation, (1998)‎‏.‏
‎4. Rodac: Hematology, Clinical Principles and Applications. W. B. Sanders Company, 2th ed. (2002).
5. Giuseppe D' Onofrio: PANDA Innovative Classification of Hematopoitic Malinancies. www.bloodline.net, Bloodline reviwes, 1(2R): 3-6, 2001.
5. G. Le Roux, C. Renoir, No Mouri, et. all: Usefulnessof ADIVA 120 Erythocyte Parameters in Myelodysplastic Syndrome. Abstracs of ISLH 14 th International Symposium, 2001‎‏.‏
‎6. Aline Hoy, Brigitte Leininger-Muller, Dolphe Kutter, et. all: Growing Significance of Myeloperoxidase in Non-infectouse Diseases. Cli Chem Lab Med,. 40(1): 2-8‎‏, ‏‎2002‎‏.‏
‎7.Neil Harris, Jolanta Kunicka, Alexander Ktatz. The ADIVA 2120 Hematology System: Flow Cytometry-Based Analysis of Blood and Body Fluids in the Routine Hematology Laboratory. Laboratory Hematology, 11:47-61 (2005).

منبع: نشریه مهندسی پزشکی شماره ۷۳