پزشکی بالینی

PDF متن کامل روش

آرتروز استخوان شایعترین اختلال سیستم ماهیچه ای – اسکلتی و یکی از آثار وقایع بیولوژیکی- مکانیکی است، که هموئوستازی بافت را در مفاصل ناپایدار می‌کند. این بیماری منجربه درد مفاصل، شکنندگی، محدودیت حرکتی، آب آوردن و درجات مختلفی از تورم می شود. اغلب مردم بالای 65 سال به نوعی آرتروز دچار هستند.آرتروز روماتیسمی (RA) نوع رایجی از آرتروزمتورم است و بالاترین آمار ابتلا را در بیماران 50-30 سال دارد. به نظر می‌رسد که خصوصیات پاتولوژیک اصل آرتروز  مربوط به ناهنجاری عملکرد بافت در غضروف پیوندی تحمل کننده وزن و استخوان های زیر غضروفی است. RA توسط کندروسیت های تولید کننده سیگنال های تورهمانند اینترلوکی،  ظهور متالوپروتئینازهای ماتریکس (MMP) ها ، کاهش تولید مهارکننده هاي MMP و شروع تولید بخش های ماتریکس نا بالغ همانند سلول های تمایز زدایی شده شناخته می شود. تمامی این تغییرات موجب نازک شدن شبکه کلاژن، کاهش در اندازه تجمعات پروتوگلیکانی، از دست رفتن پروتئوگلیکان ها در مایع سینوویال و کاهش پایداری بيوشیمیایی می شود در نتیجه درون ریزی آب ایجاد شده، که سیتوکین ها یا آنزیم ها را به درون غضروف برده و باعث تورم آن می شود.
در حالی که مهندسی بافت نتایج احتمالی زیادی را پیش بینی كرده است، اما بايد خاطرنشان سازیم که هیچ شیوه مهندسی بافتی یا هیچ شیوه درمانی تاکنون در ترمیم کامل بافتی که توانایی ترمیم خود بخودی را ندارد، موفقیت آمیز نبوده است، به عنوان مثال استخوان یکی از بافتهایی که به طور خودبخود قادر به بازسازی و ترمیم است غضروف مفصلی است.  سالهاست که مشخص شده است، که عملکرد طولانی مدت غضروف مفصلی مرتبط به ترکیب و ساختار آن است و همچنین اجزایی که به طور مکانیکی آنرا همراهی می كنند. حتی نواقص بسیار کوچک در سطح غضروف که به طور معمول ایجاد می شود، با بافتی مشبه غضروف مفصلی ترمیم نمی شود و در برخی مواقع هیچ بافتی در محل تخریب یافته تشکیل نمی شود، چنین نقصی بقیه قسمتها را نیز در بر خواهد گرفت و منجر به تخریب کل مفصل می شود. اما گاهی اوقات بازسازی غضروف مفصلی صورت می‌گیرد، بنابراین در چنین مواقعی باید به دنبال فرایندهای بازسازی بود، که برای نقص غضروف مفصلی مورد نیاز است، از قبیل ماتریکس، سیتوکین یا ترکیبات آن.
پیوند کندروسیت های اتولوگ یافته انسانی قبلا در اروپا و ایالات متحده انجام شده است، اما نخستین تلاشها برای ترسیم غضروف به صورت پیوند کندروسیت اتولوگ توسط Brittberg.e.t.al انجام شد. بعد  براي نخستین بار  این شیوه  در بیماران  با نواقص غضروفی عمیق در سطح مفصلی femoral-tibial زانوانجام شد.       

بخش هاي مورد نیاز در مهندسی بافت غضروف
پروتکل های مهندسی بافت مستلزم دست ورزی سلول های اتولوگوس جدا شده است. نمونه هاي بافت از بیماران توسط آنزیم هایی مانند کلاژناز و هیالورونیداز برای زدودن بخش های ماتریکس خارج سلولی، جدا می شوند. قسمت کوچکی از بخش سالم زانوی مجروح بیمار برداشته می شود، کندروسیت های تفکیک شده، در کشت گسترده و سپس در ناحیه مصدوم کشت می شوند.  تعداد کم سلول های در دسترس، شیوع فساد در جایگاه‌های دهنده و توانایی محدود سلول های برداشت شده برای تکثیر و تمایز از نواقص این پروتکل است.در نتیجه مطالعات بربازسازی بافت توسط پیش سازها یا سلول های بنیادی چند توان متمرکز شده است. برای اجرای موفق طرح دركلينيك دو هدف اصلی باید حاصل شوند: 1- یک روند ساده با حداقل تهاجم برای جمع آوری سلول ها از بیمار و 2- تمایز خصوصیات اساسی (مانند ثبات مکانیکی invivo, invitro در مدت کوتاه).

استفاده از منبع سلول های ایده آل برای مهندسی بافت غضروف
انتخاب یک منبع ایده آل سلولی برای مهندسی بافت نیاز به رعايت اصولي دارد، که شامل دسترسی آسان و وجود منبع سلولی مناسب، توانایی گسترش وخود سازی منبع سلولی، توانایی برای تمایز یافتن به رده های سلولی تحت سیگنال‌های ویژه و مشخص نبودن توانایی توموروژنیک و ایمنوژنیک بودن است.
در طی سالها، كاربرد سه نوع مهم از سلول ها درترمیم غضروف و مهندسی بافت مورد بررسی قرار گرفته است، که کندروسیت های committed سلول های بنیادی جنینی(ES) و سلول های بنیادی Adult نامیده می شوند. هر یک از این انواع سلولی مزايا و معايبي نسبت به دیگران دارند، که منجر به اجرای بیولوژیک ذاتی آنها می شود. به عنوان مثال سلول های بنیادی جنینی که از توده سلولی داخلی بلاستوسیت های جنینی مشتق شده توانایی تومور شدن دارند. به عبارت دیگر سلولهای بنیادی بالغ ( به عنوان مثال MSC) از بافت های مختلفی مشتق شده اند، (به عنوان مثال مغز، استخوان، چربی و بند ناف و...) که آینده ای خوبي را در پزشکی ترمیمی به دليل توانایی بالا برای خودترمیمی و خودسازی و تمایز در مدت زمان تحریک طی رده های ویژه دارند، بنابراین از آنجا که دسترسی به سلول های تمایز یافته اتولوگوس مانند کندروسیتها محدود است  و وضعیت عملکردی آنها برای بازسازی مناسب نیست. به این دلیل استفاده از سلول های بنیادی پیش ساز مزانشیمی مناسب تر به نظر می رسد. حتی بافت های تمایز یافته دارای سلول هاي تمایز نیافته توانایی بازسازی بافت پس از ضربه، بیماری و یا کهولت را دارند. چندین مطالعه آزمایشی توانایی سلول های بنیادی مزانشیمی (MSC) را برای ساختن غضروف زمانی که در ساختار حامل مناسب تثبیت شوند، ارزیابی کردند. پیوند سلول های اجدادی مزانشیمی ، درمان اختلالات ژنتیکی استخوان، غضروف و ماهیچه و مشابه آنچه در مطالعه برروی کودکان مبتلا به نقص ژنتیکی استخوان سازی وجود دارد، را تسهیل و تقريبا آنها را بر طرف می سازد. اختلالات ژنتیکی که می توانند توسط MSC درمان شوند، شامل اختلالات تخریبی مانند آرتروز استخوانی آرتروز ، پوکی استخوان و بیماریهای التهابی مانند آرتروز روماتیسمی (RA) است.

داربست ها و مهندسی بافت غضروف
از آنجا که غضروف یک بافت غیر رگی بوده دارای توانایی محدود برای خودترمیمی است و اینکه در Invivo کندروسیت ها به شکل کروی بوده، اما در Invitro به شکل فیبروبلاست و کشیده هستند و شکل گردشان را از دست می دهند، این امکان وجود دارد که بیان ژنی تغییر یابد، بنابراین وجود یک داربست مناسب و ایده آل که فنوتیپ گرد کندروسیت ها را حفظ كند ضروری به نظر می رسد.
بنابراین علاوه بر انتخاب منبع سلولی مناسب برای مهندسی بافت غضروف ، طراحی یک جزء غضروفی مهندسی شده، به عنوان مثال جزء داربست گونه ای که سلول ها روی آن قرار گیرند، لازم است. اجزای فیزیکی از قبیل طراحی، منافذ میکرو، ماکرو و توپوگرافی یک جزء مهندسی شده بافتی نقش مهمی در تغییر عملکرد بیولوژیک آن ایفا می کند. بنابراین داربست مناسب در مهندسی بافت غضروف مانند بافت های دیگر بايد شامل یک سری اجزای کلیدی باشد، كه از نظر زیستی تخریب پذیر و سازگار باشند. در ضمن متخلخل از نظر مکانیکی پایدار باشند و به سلول اجازه عبور و هدایت سیگنال های خارج سلولی را بدهند. اجزای زیستی طبیعی که برای تولید یک داربست فعال زیستی برای سلول های بنیادی که منجر به غضروف می شوند، شامل آگارز، آلجینات، هیالورونیک اسید، فیبرین و مشتقات کلاژن هستند.
یکی از مضرات این مشتقات ضعف مکانیکی که به شدت فوائد و کاربردهای کلینیکی شان را محدود می کند است.
در مقابل داربست های مصنوعي نسبت به داربست های طبیعی کمیت ها و کیفیت های مکانیکی و بیوشیمیايی و تخریب آنها در مقايسه با  پلیمرهای طبیعی به آسانی تغییر و قابل كنترل است .
پلی آلفا هیدروکسی استرهای سنتزی زیست تخريب پذير مانند پلی لاکتیک اسید (PLA) و پلی گلیکولیک اسید (PGA) به شکل گسترده در بافت های غضروف و استخوان به کاررفته‌اند، پلی گلیکولیک اسید (PGA) داربستی است که به میزان زیادی برای مهندسی بافت غضروف مورد مطالعه قرار گرفته ، اما به سرعت تخریب شده و نسبت به دیگر داربست های مصنوعي از لحاظ ويژگيهاي مكانيكي  ضعیف تر است.
پلی لاکتیک اسید پلیمری است که به آهستگی جذب می شود، این پلیمر که باMSCS های انسانی پوشانده شده، غضروف زایی را در محيط برون تني  حمایت می‌کند.
داربستهاي پلیمري نانوفیبری  polydioxanone, copolymer poly-L-Lactide-ε-Capro Lactone به عنوان نمونه ای مفید برای القای غضروف زایی بكار برده شده اند .
.هیدروژل ها نیز با این دیدگاه تکامل یافته اند تا برای رفع نواقص بافتی مورد استفاده قرار گیرند.
زمینه های پلیمر یا  قابليت اتصال متقاطع in situ که قابل تزریق هستند و سلول ها را به دام می اندازند، طراحی شده اند و تکنیک هایی که فواید هر دو ساختار ژل ها و ساختارهای فیبری متخلخل را با هم دارا هستند، به عنوان جایگزین های مناسبی برای داربست های ژلی یا فیبری در حال بررسی هستند. تحقیق همچنین بر توسعه داربست های هوشمند متمرکز شده که مهار کننده های التهاب یا آنتی بیوتیک را تحریک می کنند. ترشح آرام و کنترل شده این مولکول های فعال زیستی زمان کافی برای سازگارشدن و بالغ گشتن غضروف در یک محیط  invivo  ، موجب  جلوگیری از عفونت اولیه پس از جراحی مي شود.

جنبه های ایمنی شناسی
دو خطر ایمنولوژیکی قابل توجه در ارتباط با استفاده از پیوند های غضروفی مهندسی شده وجود دارد.
1- زمانی که میزان ماده زیستی کاهش یابد، سلول های غول پیکر مهاجم بدن یا گرانولوسیت‌ها توسط داربست ها یا مواد تثبیت کننده معینی جذب شده و به بافت هیبریدی حمله می‌کنند.
2- از آن جهت که بافت مهندسی شده کاملا بالغ نیست، سطح سلولها یا اپی توپ های پروتئینی ماتریکسی پوشانده نمی شوند. این اپی توپ ها معمولا از سیستم ایمنی مخفی می شوند و ممکن است به عنوان عامل بیگانه شناخته شوند. بیمارانی که پیوند غضروفی دریافت کرده اند، واکنش های هومورال علیه کلاژن های تیپ VI,IV نشان داده‌اند که با فیبریل های کلاژن تیپII در ارتباطند. علی رغم اینکه مهندسی بافت به عنوان درمان اتولوگی در نظر گرفته می شود، پیشرفت بالینی ، مشکلات ایمنولوژیکی توام با درمان را  خواهد داشت.
آینده مهندسی بافت
مانند بسیاری از تکنولوژی های دیگر تکنولوژی مهندسی بافت به عنوان شیوه ای موجود در حال پیشرفت است. یکی از تکنولوژی های جدید در حال پیشرفت جداسازی و گسترش سلول‌های بنیادی و شناسایی سیگنال های مورد نیاز برای تمایزشان به انواع سلولهای ویژه است. تکنولوژی دیگری که وابسته به این موضوع است، تغییرات ژنتیکی سلول ها در محیط آزمایشگاهی و محیط بدن می باشد.
اجزای ماتریکسی جدید به نظر می رسد، که با ترکیبات شیمیایی انتخاب شده پیشرفت می‌یابند، که  این امكان را می دهد تا به عنوان یک تنظیم کننده غیر محلول عملکرد سلول عمل کنند. در نهایت ، به متدهایی توجه مي شود كه  ويژگي هاي مکانیکی و رفتار بیوسنتزی سلولی را در invitro بهتر کنترل مي كند.
بنابراین مهندسی بافت دانش جدیدی را فراهم خواهد آورد، که به شناخت از ویژگی های بسیاری از انواع سلول ها وابسته خواهد بود.  این دانش به نظر می رسد، که پیشرفت های موجود در زمینه مهندسی بافت و پزشکی ترمیمی را معنا دار خواهد كرد كه عبارتند از:
- کسب توانایی خالص سازی و تکثیر و تمایز سلول های بنیادی مزانشيمی
- تعیین اپتیمم شرایط برای کشت و تمایز سلول های بنیادی مزانشیمی
- به کارگیری مطلوب ترین روش از میان متدهای موجود برای وارد کردن سلول ها در پلیمر
سلول های مزانشیمال معمولا از آسپیره مغز استخوان از ستیغ فوقانی ایلیاک درلگن انسانها جداسازی می شوند، که این عمل توسط Digirdamo و pitterger و همکاران در سال 1999  انجام شده است. همچنین این سلول ها قابل جداسازی از اجزای فمور و تیبیا در استخوان نیز هستند که توسط Murphy2002 و همکاران وTriffitαoreffo Bord در سال 1988 جداسازی شدند.
نخستین موفقیت در جداسازی کلونیهای شبیه فیبروبلاست از مغز استخوان به عنوان MSCS مربوط به 4 دهه قبل است که توسط Friedenstein و همکاران در سال 1970 انجام شده است، که این جداسازی از مغز استخوان موش صورت گرفت. اما جداسازی این سلول ها از خون بند ناف نوزاد با ترم کامل توسط اریکس(Erics) و  گودوین (God win) و همکاران تائید شده است، اما جداسازی سلول های usse از خون بند ناف نوزاد با ترم کامل توسط jager و kagler و همکاران  اخیرا صورت گرفته است.
تمایز سلول های مزانشیمی به غضروف توسط Fried enstein و همکاران در سال 1987 نشان داده شده است تمایز سلول های MSCS به غضروف در محیط حاوی یک سری ترکیب از اجزای القا کننده مختلف شامل اعضای خانواده TGFB بویژه TGFB1, TGFB3  صورت گرفته است. دیگر فاکتورهای القا کننده تمایز غضروفی برای پیش سازهای مزانشیمی Multipotent شامل BMP-2 و BMP-6 ، IGF-1 ، bFGF صورت گرفته است،  همچنین تمایز غضروفی MSCS توسط دگرامتازون القا می شود، اگرچه کارایی آن در مقایسه با TGF-B کمتر است.
استراتژی های بر اساس داربست هایي که هم به صورت مصنوعي و هم به صورت طبیعی وجود دارند و برای ترمیم غضروف مورد استفاده قرار گرفته اند همانند : پلیمرهای طبیعی شامل آلجینات، فیبرین، کیتوسان، هیالورونان، پلی (گلیکولیک اسید)، پلی (لاکتیک اسید)، پلی (کاپرولاکتون) و بسیاری از کو پلیمرهای پلی استر به طور وسیعی به عنوان داربست مورد استفاده قرار گرفته اند.
استراتژی مهندسی بافت غضروف بر اساس کندروسیت های In vitro برای ترمیم غضروف در دهه گذشته به طور وسیعی مورد استفاده قرار گرفته  و پیشرفتهایی نیز در این زمینه تاکنون بدست آمده است،  اما استفاده از MSCS برای ترمیم غضروف هنوز در مراحل اولیه است.
برای ایجاد تمایز غضروفی، MSC در غلظت بالا در محیط سه بعدی کشت مي يابند، به گونه ای که اندرکنش سلول به سلول بسیار بالا بوده و برای القای غضروف زایی مناسب است.
بررسی های اخیر نشان داده که سلول های مزانشیمی هنگامیکه در یک محیط کشت Cell pellet(cp) قرار می گیرند اجزای غضروف را تولید می‌كنند.
داربست های هیدروژلی و غیر هیدروژلی به عنوان داربست های زيست تخريب پذير ،  بسیار انعطاف پذیر بوده و برای ترمیم نواقص بافتی، به خاطر شکل نامنظمی که دارند و به علاوه به این دلیل که سلول های مزانشیمی را تحت فشار قرار می دهند، تا کروی شکل شده و فنوتیپ غضروف زایی خود را حفظ كنند به كار گرفته مي شوند.
داربست های غیر هیدروژلی که تا کنون مورد استفاده قرار گرفته اند، برای غضروف زایی سلول های مزانشیمی از پلیمرهای تخریب پذیر زیستی مصنوعي بدست آمده اند و به اشکال اسفنجی، فوم مانند یا رشته ای مانند بوده و بسیار متخلخل هستند، علاوه بر این داربست NFSS که از نظر زیستی تخریب پذیر است برای کشت انواع مختلف سلولی مورد استفاده قرار گرفته است و به نظر می رسد که برای مهندسی بافت استخوان  و غضروف مناسب است.
ماتریکس کلاژن نوع I به عنوان یک ناقل تخریب پذیر زیستی بیولوژیکی نیز برای غضروف زایی سلول ها  در محيط برون تني مورد استفاده قرار گرفته است و همچنین پلیمر پلی گلیکولیک / پلی لاکتیک اسید (E210) نیز به عنوان ناقل مصنوعي تخریب پذیر زیستی استفاده شده است.
در مطالعات دیگر نشان داده شده است، که داربست هایی از قبیل پلی اتیلن گلیکول  و هیدروژل هایی بر اساس آگارز نيز براي  غضروف زایی مناسب است.
داربست کلاژن GAG نیز قادر است که غضروف زایی را حمایت کند، که این داربست برای تمایز غضروفی سلول های مزانشیمی مشتق شده از مغز استخوان Rat مورد استفاده قرار گرفته است.
HYAF یک داربست قابل تخریب و قابل جذب است که از استری شدن هیالورونات سدیم ايجاد  شده است و جزء مهم ماتریکس غضروفی خارج سلولی است  نقش مهمی در فرایند بیولوژیک بازی می کند، كه تمایز کندروسیت ها را تحت تاثیر قرار می دهد .
(poly-laclic-, lycolic-acid) نیز داربستی است، که سلول ها قادرند روی آن قرار گیرند، بدون این که از بین بروند وبرای تمایز غضروفی در invivo در خرگوش مورد مطالعه قرار گرفتند.
داربست های شیشه ای بسیار متخلخل ، نشان داد،  که برای غضروف زایی و استخوان زایی msc مشتق شده از مغز استخوان مناسب است.
در نهايت در حال حاضر دو محصول غضروف و پوست توسط مهندسي بافت به دلايل عدم پيچيدگي بافتهاي ذكر شده و همچنين تحقيقات فراوان در اين زمينه ها همان طوريكه در اين مقاله به طور خلاصه به آن اشاره شده به صورت تجاري در دسترس ميباشند.
مراحل شكل گيري و مهندسي بافت غضروف و استخوان
شكل سمت چپ داربست پليمري و شكل سمت راست غضروف ساخته شده توسط سلولها و داربست پليمري  را نشان مي دهد

منبع: نشریه مهندسی پزشکی شماره ۷۸