پزشکی بالینی

اصول فلورسانس و تکنولوژی انعکاس نوری در بلادگزهای OPTIMedical

سیستم های اندازه گیری گازهای خون با استفاده از پدیده فلورسانس و سنسورهای نوری سال 1984 به وجود آمدند. در این مقاله قصد داریم اصول پایه و عملکرد سنسورهای شیمیایی-نوری را در دستگاه Blood gad OPTIMedical  بررسی کنیم. این دستگاه با استفاده از جدیدترین تکنولوژی نوری، نه تنها PH و گازهای خونی مانند اکسیژن و دی اکسید کربن را اندازه گیری می کند، بلکه اندازه گیری و محاسبه الکترولیت هایی چون K+، Cl-، Ca++ و Na+، متابولیت هایی چون گلوکز و اوره، مقدار کل هموگلوبین tHb و اکسیژن اشباع شده SO2 را نیز انجام می دهد.

فلورسانس چیست؟
اگر به مولکولی انرژی داده شود یا تحریک شود، این مولکول بر انگیخته شده و زمانی که به حالت پایدار خود باز می شود از خود نور ساطع می کند. به این فرایند لومینسانس می گویند. حال اگر انرژی تحریک به صورت نور باشد، به این فرایند فلورسانس گفته می شود.
 OPTIMEDICALبدون نیاز به محلول و الکترود، در زمانی کمتر از 3 دقیقه به صورت اتوماتیک تمام این پارامترها را در 125میکرولیتر خون، پلاسما یا سرم اندازه گیری می کند، همین امر باعث بالا رفتن صحت نتایج و پایین آمدن قیمت نگهداری دستگاه و همچنین قیمت تست های انجام شده است.
از اين آزمايش، معمولا جهت سنجش كفايت اكسيژن‌رساني و عملكرد مطلوب ريه‌ها، كليه‌ها و سيستم متابوليسم بدن در بيماران بستري در بيمارستان استفاده مي‌شود. انجام اين آزمايش، ساده است، نتيجه آن، به سرعت آماده شده و كاربرد زيادي نيز در موارد اورژانس دارد.
 
سنسورهای نوری "اپتود"

سنسورهای نوری در کاست OPTI به گونه ای طراحی شده است که آنالیت به مولکول سنسور فلورسنت متصل می شود. مولکول سنسور قابل تنظیم برای آنالیت های مختلف است.

نحوه عملکرد سیستم اندازه گیری بدون الکترود
همانطور که در شکل مشخص شده است، یک LED، نوری آبی با طول موج و شدت مشخص تولید می کند که این نور توسط شکافنده پرتو  (Splitter)به سنسور کاست تابیده شده و در سنسورهای کاست عمل فلورسانس انجام می پذیرد.
نور فلورسانس سنسورهای کاست از شکافنده گذشته و توسط یک لنز و فیلتر به سنسور گیرنده می رسد.سنسور گیرنده بنا به شدت نور فلورسانس آنرا به ولتاژ متناظر تبدیل می کند. این ولتاژ توسط پروسسور دستگاه تحلیل و عدد دهی می شود.
شدت نور فلورسنت خارج شده، بسته به غلظت یون های (+K, +Na, +H) یا فشار نسبی مولکول های گاز (CO2 , O2) در نمونه تغییر می کند. برای هر آنالیت، رابطه مشخصی بین آنها مشخص است.
لایه حسگر شامل یک رنگ ثابت فلورسانس است که به بالای فویل فرستنده نوری پلی استر  چسبیده است. لایه حسگر با پوششی سیاه پوشانده شده است که قابلیت عبور آنالیت را دارد. این لایه پوشاننده مانند حفاظی عمل می کند که لایه حسگر را از نورهای مزاحمی که از جایی غیر نمونه خون می آید محافظت می کند. بخش زیری این فویل از لایه چسبناکی پوشیده شده که باعث چسبیدن دیسک سنسور به کاست می شود.
تمام سنسورهای اپتود از فویل های ترکیبی ساخته شده اند. دیسک های منحصر به فرد سنسور با ضخامتی حدود 4 میلیمتر، برای نگهداری کاست به کار می روند. بیشتر اپتودها تعادلی و برگشت پذیر هستند همین مساله سبب شده که آنالیت های خون یا نمونه سرم تا زمانی به داخل سنسور کشیده شوند که به یک غلظت ثابت و پایداری برای اندازه گیری برسند. در خصوص گاز اکسیژن و دی اکسید کربن، مقداری از گاز به پلاستیک دور سنسور منتشر می شود که مشابه آنالیزرهای الکتروشیمیایی معمولی به یک فاکتور اصلاحی نیاز دارند.

ساختار کاست های OPTI
کاست ها محفظه های پلاستیکی هستند که قالب آن دو بخش به هم چسبیده است و از یک دریچه، یک پورت مکشی جهت کشیدن نمونه، یک مبدل سرنگ و همچنین دیسک سنسور نوری تشکیل شده اند. درون کاست ها مایعی وجود دارد.مبدل سرنگ پس از اتصال مستقیم به سرنگ، اتوماتیک نمونه را از داخل آن مکش می کند.بخش پایینی قالب شامل یک مبدل برای اتصال به دستگاه است که از طریق شش محفظه استوانه ای شکل دیسک سنسور را تثبیت می کند، پس از پایان اندازه گیری کاست را قفل کرده تا امکان اندازه گیری مجدد با همان کاست وجود نداشته باشد. بخش بالایی قالب شامل مجرایی است که در ارتباط با پورت مکشی جهت کشیدن نمونه خون قرار می گیرد. همچنین دریچه ای وجود دارد که پس از اندازه گیری بسته شده و مانع از بیرون ریختن پسماندها می شود.

تجهیزات OPTI-CCA
قلب دستگاه شامل یک محفظه اندازه گیری با دمای کنترل شده است که کاست در آن قرار داده شده و به صورت نوری چک می شود.
بخش الکترو-نوری شامل شش مجموعه از LED های آبی رنگ به عنوان منابع نوری و آشکارسازهای فوتودیودی است. همچنین مجموعه ای از فیلترهای میان گذر وجود دارد که با کمک دو Splitter نور دورنگ به صورت طیفی، نور تحریکی آبی را از نورهای تابشی فلورسانسی سبز و قرمز تفکیک می کند. پس از تقویت و تبدیل آنالوگ به دیجیتال، سیگنالها به صورت دیجیتالی پردازش شده و مقادیر آنالیت ها نمایش داده می شوند. دمای لازم برای الکترونوری ها و کاست ها 37 درجه با C°1± دقت است.
در ادامه این سیستم نوری، سیستم انعکاس نوری دیگری وجود دارد که از دیود های لیزر قرمز و مادون قرمز برای انجام اندازه گیری پخش نوری چند طول موجی جهت تعیین هموگلوبین و اشباع اکسیژن استفاده کرده است.
تمام تجهیزات خشک هستند و شامل هیچ ماده شیمیایی یا فاضلاب نیستند که به منظورمکش نمونه از سیستم پنوماتیک بسیار ساده ای با گاز کالیبراسیون استفاده می کند.
پمپ پری استالتیک، گاز کالیبراسیون را به صورت معکوس در سیستم به جریان می اندازد بدین ترتیب ساکشنی ایجاد شده که سبب مکش نمونه خون می شود.
این سیلندر گاز ترکیب دقیقی از 0.02±14 درصد اکسیژن،  0.02±6 درصد دی اکسید کربن و نیتروژن موازنه شده است. این مخزن دو لیتری گاز حدود 10 بار فشار دارد که برای انجام حدود 100 کالیبراسیون کافی است.این گاز کالیبراسیون بسته به بارکد کاست ها، کالیبراسیون خاصی را برای سنسورهای اپتود انجام می دهد.

اندازه گیری O2
PO2 بیانگر فشار اکسیژن موجود در خون است که بنا به عملکرد ریه ها مقداری بین 80 تا 100 میلیمتر جیوه دارد. در حین اندازه گیری اکسیژن میزان فلورسانس سنسور O2 در مجاورت اکسیژن کم می شود. پس هرچه فلورسانس بیشتر، درصد اکسیژن کمتر و هرچه فلورسانس کمتر درصد اکسیژن بیشتر خواهد بود. در کلیه سنسورهای نوری، لایه آشکارساز به آنالیت های داخل شده استناد کرده تا به یک غلظت ثابت و مانایی برسند.در اپتود اکسیژن، لایه آشکارساز حاوی یک ماده فلورسانس روتنیوم رنگی حساس به اکسیژن با قطر 50 میکرون است که توسط ذرات رنگی میکس شده با نوعی پیش پلیمر جذب شده اند. این لایه پس از بهبود با یک پوشش سیاه سیلیکونی غیر فلورسانسی، روی هم قرار داده می شوند.منحنی کالیبراسیون سنسور O2 از ماهیت استرن-ولمر رنگ های لومینسانس مشتق می شود که از رابطه زیر تبعیت می کند:در این رابطه S شدت نسبی فلورسانس است که بیانگر میزان PO2 است. Sm ماکزیمم شدت است که در اکسیژن صفر دیده می شود. f1 و f2 فاکتورهای کوچک توزین شدت و ksv1 و ksv2 ثابت های استرن-ولمر هستند.
در مقایسه این سنسورها با بلادگزهای الکتروشیمیایی که از الکترود استفاده می کنند، مشاهده می کنیم که چون هیچ اکسیژنی مصرف نشده و الکترود مرجعی مورد نیاز نیست، این سنسور ها محاسن قابل توجهی برای اندازه گیری نمونه خون های کوچک دارند.

اندازه گیری PH

 PHنشان دهنده ميزان اسيديته خون است و مقادير آن تحت تأثير كاركرد صحيح كليه، ريه و متابوليسم بدن است. PH نرمال مقداری بین 7.36و 7.44 دارد. سنسور اندازه گیری PH فقط با یون هیدروژن واکنش می دهد و زمانی کهون های هیدروژن به آن می چسبند شدت فلورسانس کمتر می شود ، لایه آشکارساز سنسور PH شامل فیبرهای سلولزی آمینو اِتیلی با قطرmum8 هستند. که ترکیبی از یک ماده رنگی فلورسانسی حساس به PH و HPTS (اسید هیدروکسی پیرن تری سولفونیک) است. لایه حساس به PH دارای پیوندهای کووالانسی بوده و از فیبرهای مملو از رنگ ساخته شده که قابلیت نفوذ یون را دارد و باعث محافظت از فویل می شود.به منظور ایزوله کردن نوری، این لایه آشکارساز با یک هیدروژلِ سیاه رنگِ پوریول اِتان پوشانده شده است.منحنی کالیبراسیون سنسور PH از قانون جرم به دست آمده و رابطه بین PH و شدت فلورسانس رنگ های آشکارسازPH که مانند یک اسید ضعیف عمل می کنند را نشان می دهد.این تابع نشان می دهد که افزایش شدت فلورسانس بدین معنی است که PH زیاد می شود و نقطه عطف آن در PH نرمال فیزیولوژیک قرار گرفته است.
در حالت HPTS، وقتی تحریکی در حدود 470nm در محیطی آبی رخ دهد، هیچ فلورسانسی از گونه های فلورسانسی پروتن دار شده تولید نمی شود.تابع کالیبراسیون به سادگی با رابطه زیر قابل بیان است:
S = [Sm / 1 + 10(pK - pH)]
که بازهم S شدت نسبی فلورسانس است که بیانگر میزان PH است. Sm ماکزیمم شدت است که در بالاترین PH دیده می شود. pk نیز منفی لگاریتم ثابت تفکیک پروتن آشکارساز است.
به علت این سه بار منفی، pk وابستگی زیادی به قدرت یونی دارد که کاملا تحت تاثیر غلظت سدیم خارج سلولی قرار می گیرد. بنابراین همیشه در سیستم OPTI CCA سدیم به طور مستقل اندازه گیری شده و از آن برای محاسبه قدرت یونی به منظور تصحیح ضریب تفکیک HPTS استفاده می شود. این مساله سبب می شود که در هر دو حالت پایین و بالا بودن میزان سدیم خون، مقدار PH فیزیولوژیک با دقتی بسیار بالا تعیین شود.

اندازه گیری PCO2
PCO2 نشان دهنده فشار گاز دي‌اكسيد كربن موجود در خون است که باید بین 35 تا 45 میلیمتر جیوه باشد. این مقادير تحت تأثير عملكرد ريه‌ها است.
سنسور PCO2 نیز مانند سنسور PH عمل می کند با این تفاوت که در این سنسور لایه آشکارساز با یک لایه سیلیکونی سیاه پوشانده شده که دارای غشائی است که یون H+ نمی تواند از آن عبور کند و فقط CO2 از آن عبور نموده و با سنسور واکنش می دهد.
اصول عملکرد مانند همانی است که در ABG های الکتروشیمیایی متداول که از الکترود استفاده می کنند به کار برده می شود. لایه حساس به PH همواره با محلول بافر موازنه است، CO2 در سطح آن منتشر شده و به طور موضعی با PH بافر داخلی به تعادل می رسد.
از آنجایی که پوشش رویی نسبت به یون های هیدروژنی نفوذپذیری ندارد، مقدار PH لایه آشکارساز تحت تاثیر PH نمونه نبوده و تنها با PCO2 ی نمونه خون تعیین می شود.
تابع عملکرد اپتودهای CO2 از ترکیب تابع کالیبراسیون PH داخلی اپتود و ارتباط بین PH و PCO2 ی بافر میانی بی کربنات داخلی به صورت زیر به دست می آید:
S = [Sm / 1 + 10(pK - pH)];    pH = f(PCO2,buffer)
هرچه شدت فلورسانس بیشتر باشد به معنی CO2 کمترو بالعکس اگر شدت فلورسانس کمتر باشد به معنی CO2 بیشتر است.

اندازه گیری SO2 و tHb به روش انعکاس
سنسور PO2 در کاست OPTI دارای دو عملکرد است. اولین عملکرد آن مشابه تمامی سنسورها، اندازه گیری اکسیژن است. دومین عملکرد آن آنالیز کل هموگلوبین (ctHb) و اشباع اکسیژن (SO2) است. بر خلاف سایر سنسورها، سنسور O2 حاوی روکش صورتی است که به عنوان منعکس کننده عمل می کند و در اندازه گیری فتوفیزیک O2Hb و HHb دخیل است. اندازه گیری فتوفیزیک، غلظت  O2Hb و HHb را آنالیز می کند. مجموع دو مشتقات هموگلوبین، بیانگر ctHb و نسبت درصدی بین O2Hb و HHb بیانگر SO2 است. این روش از سه طول موج در محدوده قرمز و مادون قرمز استفاده می کند و دو مشتق هموگلوبین را در خون همولیز نشده اندازه گیری می کند.

اپتودهای کاتیون
برای اندازه گیری الکترولیت های سدیم، پتاسیم و کلسیم در مایعات خارج سلولی مجموعه ای دیگر از رنگ های آشکارساز استفاده می شود. سنسورها هرکدام شامل مولکول های رنگی فلورسانسی هستند که با یونوفورهای خاصی پیوند داده شده اند و بسته به غلظت یون ها خروجی فلورسانس را تعیین می کنند. هر سه سنسور مشابه سنسورهای PH هستند که فقط در رنگ های آشکارساز و توابع کالیبراسیون تفاوت هایی دارند.
در تمام این رنگ ها طراحی مشترکی به کار برده شده است که هرکدام شامل یک المان شناسایی یونوفوری است که می تواند آنالیت مورد نظر را شناسایی کند.
طراحی این یونفورها به گونه ایست که به تغییرات فیزیولوژیکی PH حساس نیست. همچنین ساختار حفره ای مانند این یونفورها باعث ایجاد حساسیت فوق العاده ای در برابر یون مربوطه می شود. یونفور از طریق المان واسطی با المان رنگی فلورسانس یا فلوروفور پیوند یافته است.
فلوروفور برای هر سه رنگ، یک آمینو نفتالین است که در محیط مرطوب پایداری شدیدی در برابر هیدرولیز شدن دارد، همچنین قابلیت تحریک LED های آبی و انجام عمل سوییچینگ را نیز دارند.
در آخر یک گروه پیوند دهنده به بخش پایینی فلوروفورها وجود دارد که برای اتصالات کووالانسی به پلیمر ها استفاده می شود.
هرکدام از این مولکول ها مانند یک سوییچ عمل می کنند یعنی وقتی کاتیون مورد نظر مجاور یونفورها می شود فلوروفور به حالت ON سوییچ می شود.

فلورو- یونوفور سدیم
تحت شرایط نرمال یعنی در نبود سدیم، مولکول ها به علت مکانیسم دافعه بین مولکولی به وضعیت OFF سوییچ می شوند. بلافاصله پس از اینکه فلوروفور به صورت نوری تحریک شد انرژی آن به صورت داخلی جذب شده و یکی از الکترون های نیتروژن منتقل می شود. در این حالت سوییچ OFF است. وقتی یک یون سدیم با یونوفور مجاور می شود، الکترونهای تک جفت نیتروژن با کاتیون سدیم به اشتراک گذاشته می شود و هیچ الکترونی مبادله نمی شود، به همین دلیل فلورسانس روشن می شود (سوییچON). نسبت روشن بودن به خاموش بودن گونه های فلورویونفورها، بستگی به غلظت آنالیت یون دارد. در نتیجه، مقدار کلی شدت فلورسانس متناسب با غلظت کاتیون است.
فلورو- یونفور پتاسیم
به صورت مشابه، یونوفور پتاسیم به شدت  یون های پتاسیم را انتخاب می کنند. ساختار حفره مانند فلورو- یونفور پتاسیم، به کوچکترین یون پتاسیم اجازه می دهد تا با کمترین نیرو مستقیما به حفره ها منتشر شود.

سنسور گلوکز
این سنسور نیز مانند بیوسنسورهای گفته شده عمل می کند. توجه داشته باشید که با انتشار گلوکزهای خون به داخل لایه آشکارساز، بی درنگ با آنزیم اکسیداز گلوکز ترکیب  شده و به صورت پیوسته اکسیژن مصرف می کند. این مصرف اکسیژن به سرعت به وسیلهک اپتود اکسیژن اندازه گیری شده تا PO2 را به دقت اندازه گیری کند.

طراحی سیستم OPTI CCA
پس از تولید کاست ها در مقیاس زیاد، بنا به نوع سنسور هر کاست، توابع کالیبراسیون را تعیین می نمایند. به این ترتیب که تعدادی کاست و سنسور را به طور نمونه انتخاب می کنند، تست های چندگانه ای روی آن انجام داده و بدین ترتیب با اندازه گیری محدوده  عملکرد هر آنالیت و با کمک واسطه های مایع و گازی، کاست ها را کالیبره می کنند. سپس این اطلاعات به صورت آماری تجزیه تحلیل شده تا برای هر نوع از کاست ها مقدار شیب و ضریب تصحیح را به دست آورند. برای هر بسته، برچسب بارکدی تخصیص داده می شود که شامل اطلاعاتی چون اطلاعات کالیبراسیون کارخانه ، تاریخ انقضاء و شماره کاست است.
بسته های حاوی کاست را می توان تا 8 ماه قبل از استفاده در دمای اتاق (4-30 درجه سانتی گراد) نگهداری کرد.
در زمانی که کاست را به منظور اندازه گیری در محفظه قرار می دهیم به صورت اتوماتیک کالیبره می شود. در حقیقت این کالیبراسیون مقدار Sm را برای هر سنسور تعیین می کند.
پس از کالیبراسیون و اتصال به سرنگ حاوی نمونه مورد نظر، دستگاه به صورت اتوماتیک  mul125 از خون، سرم یا مایع کنترل کیفیت را به داخل کشیده و اندازه گیری را انجام می دهد، اطلاعات آنالیز با اطلاعات کالیبراسیون موجود در کارخانه ترکیب شده و سبب بالا رفتن کیفیت نتایج می شود. پس از آنالیز کاست به صورت اتوماتیک مهر و موم شده سپس آن را از دستگاه در می آوریم.
این کار در زمانی کمتر از 90 ثانیه انجام می گیرد. سیکل کامل که شامل کالیبراسیون و مکش و اندازه گیری است حدود 150 ثانیه به طول می انجامد.
در صورت مواجهه با مشکلاتی چون: وجود حباب هوا، لخته خون، خطاهای کالیبراسیون کاست، خطاهای کاربردی و ..  دستگاه پیغام داده و باید اندازه گیری دوباره را تکرار کرد.
البته در1500 اندازه گیری آزمایشی، 1 درصد از آزمایشات با چنین مشکلاتی مواجه شد  که بخش بزرگی از آن به کاربران غیر متخصص مربوط می شد.
در منوی دستگاه پارامترهای زیادی وجود دارد که سبب می شود تا این سیستم برای استفاده پرتابل یا متمرکز مانند NICU، اتاق اورژانس، اتاق عمل یا آزمایشگاه مناسب شود. از دیگر مزایای سیستم مبنی بر اپتود می توان به استفاده آسان، دقت بالا و بدنه مقاوم آن اشاره کرد.

منبع: نشریه مهندسی پزشکی شماره ۸۷