تجهیزات179- ميكروسكوپهاي نوري آزمايشگاهي
ميكروسكوپ نوري آزمايشگاهي از نور مرئي كه به وسيلهي سيستمهاي عدسي متمركز شده است تا نمونههاي تحت بررسي را بزرگنمائي كند، استفاده ميكند. اين دستگاه يكي از اجزاي پايهي يك آزمايشگاه باليني است و تقريبا در هر بخش از آزمايشگاه، از شيمي (براي ادرارسنجي) تا هماتولوژي، سيتولوژي، هيستولوژي و ميكروبيولوژي استفاده ميشود.
در هـمـــاتـــولـــوژي، آنــالـيــز مـيـكــروسـكــوپــي سـلــولهــاي خــونــي بـراي تشخيـص لـوسمـي، آنمي، و ديگر اختلالات خوني و نيز عفونتها و آلـرژيهـا اسـتـفاده ميشود. در سيتولوژي و هــيــســتــــولــــوژي، مــــيتــــوان بـــا بـــررســـيهـــاي ميكروسكوپي، بر اساس تغييرات غيرطبيعي در سلولها يا بافتها، شرايط خوش خيم، بدخيم، التهـاب و پيـش سرطاني را از هم تفكيك كرد. بــررســي مـيكـروسكـوپـي urinary sediment، در تعيين عملكرد كليه اهميت خيلي زيادي دارد و تـركـيـب بـررسـيهـاي مـاكـروسـكـوپي (ارزيابي شيميائي) و ميكروسكوپي، ادرارسنجي كامل را فراهم ميكند. تكنيكهاي انتخابي رنگ آميزي نيز ميتوانند براي كمك به شناسائي قارچها، parasites و بـــاكــتــريهــا، در مـيـكــروسـكــوپــي استفاده شوند.
انواع ميكروسكوپ نوري
ميكروسكوپهاي
نوري از نور مرئي و يك سـيـسـتــم عــدســي بــراي بــزرگـنـمـائــي
تـصـاويـر نــمــــونــــههــــاي كــــوچـــك اسـتـفـــاده
مـــيكـنـنـــد. مـيـكــروسـكــوپهــاي اپـتـيـكــال قــديـمــي تــريـن
طراحي ميكروسكوپها هستند و احتمالا در قرن 17به شكل فعلي شان طراحي
شدهاند. نوع پــايــهي آنهــا مـيتـوانـد بسيـار سـاده بـاشـد؛ امـا
طـراحـيهـاي بـسيار پيچيده هم با هدف بهبود رزولـوشـن و تمايز نمونهها
ارائه شده اند. اين ميكروسكوپها مرسوم اند زيرا نور مرئي در آنها استفاده
شده است و لذا ميتوان نمونهها را مستقيم با چشم مشاهده كرد.
تصوير
يك ميكروسكوپ نوري را ميتوان با دوربينهاي معمولي حساس به نور اخذ كرده و
يك ميكروگرام به دست آورد. در اصل، تصاوير با فيلم عكاسي به دست مي آمدند
اما توسعههاي مدرن در دوربينهاي CCD و CMOS امكان اخذ تصاوير ديجيتال را
فراهم كرده اند. ميكروسكوپهاي منحصرا ديجيتال نيز امروزه موجود هستند كه
از دوربين CCD براي بررسي يك نمونه استفاده ميكنند و تصوير حاصل را
مستقيما روي صفحهي كامپيوتر نشان ميدهند بدون اين كه نياز به قطعهي چشمي
باشد.
ميكروسكوپ آزمايشگاهي نوري با زمينه روشن (Brightfield) نمونه را به صورت محوري با نور سفيد
روشن
ميكند؛ به نحوي كه شي روي يك پس زمينهي روشن ديده شـود (شكـل 4.) بسيـاي
از نمـونـههـاي ميكروسكوپي، رنگ آميزي شده و به صورت بخشهاي باريك بريده
ميشوند؛ به صورتي كه جزئيات سطحي و ساختار آنها را بتوان با استفاده از
ميكروسكوپهاي با زمينه روشن تشخيص داد. اين ميكروسكوپها، با اجزا و
متعلقات مناسب، ميتوانند براي ميكروسكوپي phase-contrast، فلورسنس، و/يا
زمينه تاريك (darkfield) پيكربندي شوند.
ميكـروسكوپهاي آزمايشگاهي
نوري با زمينه تاريك، نمونه را از زواياي مورب روشن ميكنند به نحوي كه روي
يك پس زمينهي تاريك، نمونه روشن به نظر ميرسد (شكل 5.) اين ميكروسكوپها
در ميكروبيولوژي و سيتولوژي استفاده ميشوند.
ميكروسكوپي فلورسانس از
تشعشعات موج كوتاه (به عنوان مثال نور ماوراءبنفش) استفاده ميكند تا نمونه
هائي كه به صورت طبيعي فلئورسانت هستند يا نمونههايي كه با رنگهاي
فلئورسانت رنگ آميزي شده اند (فلئوروكرومها) را برانگيخته كنند. زماني كه
اين نمونهها با نوري با طول موج صحيح برانگيخته شوند، روشن خواهند شد و در
طيف مرئي، قابل تشخيص هستند. فيلترهاي خاصي براي محدود كردن طول موجهاي
نور تـابيـده شده به نمونه و مقدار نور تحريك كه توسط نمونه جذب نمي شود
استفاده ميشوند.
مـيـكــروسكـوپهـاي آزمـايشگـاهـي نـوري تـداخلـي (Interference)، بـراي تقـويـت تفاوتها در تصوير،
تفاوتهاي
مسير نوري در شي را معكوس ميكنند. اين كار را ميتوان با تداخل بين نوري
كه از شي ميگذرد و نوري كه از يك مسير بدون مانع مــيگــذرد، انـجــام
داد. مــرسـومتـريـن روش DIC يـا differential interference contrast است
كه نور منبع را قطبي كرده و به دو پرتو تجزيه ميكند. اين پرتوها در جهات
كمي متفاوت حركت ميكنند و از شي ميگذرند و سپس دوباره با هم تركيب
ميشوند. سپس اختلافهاي مسير نوري به صورت تفاوت در شدت و رنگ (رنگ آميزي
رنگي نوري) ديده ميشوند. اين ميكروسكوپها امكان ديدن نمونههاي زنده يا
برشهاي باريك رنگ آميزي نشده، را با تمايز بالا فراهم ميكنند.اپتيك،
در ميكروسكوپهاي phase-contrast، فاز نور منكسر شده توسط نمونه را به
اندازهي يك چهارم طول موج، در مقايسه با نور مستقيم منحرف نشده كه از داخل
نمونه يا اطراف آن ميگذرد، تغيير ميدهد. با اين كار، امكان مشاهدهي
جزئيات بدون ثابت كردن و رنگ كردن نمونه فراهم ميشود.
نور قطبي شده،
كنتراست را بهبود ميدهد و جزئياتي را كه در شرايط ديگر ديدن آنها مشكـل
اسـت قـابـل روئـت ميكند. ميكروسكوپهاي با نور قطبي شده، ميتوانند
اطلاعاتي در مورد شرايط و ساختار نمونه فراهم كنند.
ميكروسكوپهاي استريو (Streo)، دو هدف براي مشاهده و دو چشمي دارند و لذا يك ديد سه بعدي از
نمونهي
تحت بزرگنمائي كم فراهم ميكنند- معمولا بزرگنمائي از شصت برابر بيشتر
نيست.- اين ميكروسكوپها براي ديدن سه بعدي نمونههاي زنده يا بزرگ استفاده
ميشوند.
ميكـروسكـوپهـاي inverted-stage بـراي مطـالعـهي
ميكـروسكـوپيك نمونههاي بزرگ با نور انتقالي استفاده ميشوند و طراحي آنها
به اين صورت است كه اشيا در زير stage و روشنائي در بالاي آن، قرار
ميگيرد. اين ميكروسكوپها در آزمايشگاههايي كـه لقـاح آزمـايشگـاهـي و
كشـت بافت انجام ميدهند استفاده ميشوند بهعلاوه در كاربردهاي تحقيقاتي
مختلف نيز، به كار ميروند. بافتهاي كشت داده شده را ميتوان در انواع
مختلف ظروف (به عنوان مثال پتري ديشها، بطريهاي نمونه)، بشقابهاي
ميكروتست و ميكروتيتر بررسي كرد.
پيكربندي نوري
دو نوع پيكربندي پايه در ميكروسكوپهاي اپتيكال مرسوم وجود دارد: ساده (تك عدسي) و تركيبي (تعداد زيادي عدسي.) عمدهي ميكروسكوپهاي تحقيقاتي مدرن از نــوع تــركـيـبــي هـسـتـنــد در حـالـي كـه بـرخـي از انـواع ميكـروسكـوپهـاي ارزانتـر، مـيـكـروسـكـوپهـاي سـادهي تـك عدسي هستند. اساسا يك شيشهي بزرگنما، يك ميكروسكوپ پايهي تك عدسي است. در حالت كلي اپتيك ميكروسكوپ، استاتيك است؛ براي كانوني كردن در عمق هاي متفاوت، بايد فاصلهي نمونه و عدسي تنظيم شود و براي به دست آوردن يك زمينه ديد وسيعتر يا محدودتر، بايد از عدسي شي اي با بـزرگـنـمـائـي مـتـفـاوت استفاده شود. اغلب ميكروسكوپهاي تحقيقاتي مدرن، يك مجموعهي جداگانه براي روشن كردن تصوير دارند.
ميكروسكوپ تك عدسي (ساده)يك ميكروسكوپ ساده تنها از يك عدسي براي بزرگنمائي استفاده ميكند، اين طــراحــي پــايــهيمـيكـروسكـوپ نـوري اسـت. مـيـكــروسـكــوپهـاي Van Leeuwenhoek يـك عدسي ساده و كوچك همگراكننده دارند كه با مكـانيـزم پيـچ بـراي نگـه داشتـن نمـونـهي مورد بررسي، روي يك صفحهي برنجي قرار گرفته است.
ميكروسكوپهاي تركيبييـك ميكـروسكـوپ تـركيبـي از چنـد عدسي براي جمع كردن نور از نمونه و يك مجموعهي ديگر از عدسيها براي متمركز كردن نور روي چـــشــــــم يــــــا دوربـــيــــــن اســـتـــفــــــاده مـــــيكــنـــــد. ميكروسكوپهاي تركيبي سنگينتر، بزرگتر و گرانتر از ميكروسكوپهاي ساده اند؛ چرا كه تعداد عدسيهاي مورد استفاده در ساختن آنها بـيـشـتر است. مزيت اصلي چند عدسي، بهبود NA، كاهش خطاهاي كروماتيك و عدسيهاي شـي اي قـابـل تـعـويـض براي تنظيم بزرگنمائي اسـت. هـمـچـنـيـن يـك مـيـكـروسـكـوپ تـركيبي چيدمانهاي پيشرفته تري، مانند كنتراست فاز، براي روشنائي دارد.
تكنيكهاي روشنائي
با
اين كه تكنولوژي ميكروسكوپ و اپتيك از حدود 400 سال پيش در دسترس بوده
است، اما تكنيكهاي مربوط به روشنائي نمونه براي ايجاد تصاوير باكيفيتي كه
امروز ديده ميشوند، اخيرا توسعه يافته اند.
در آگوست 1893 Kohler
روشنايي Kohler را ابداع كرد. اين روش، منجر به نورپردازي بسيار يكنواخت
نمونه ميشود و بسياري از محدوديتهاي تكنيكهاي قديمي تر براي نورپردازي
نمونه را ندارد. قبل از اين روش، تصوير منبع نور به عنوان مثال فيلمان چراغ
برق هميشه در تصوير نمونه ديده ميشد.
فيزيكداني به نام Fritz Zernike
در 1953 به خاطر ايجاد روشنائي كنتراست فاز جايزهي نوبل فيزيك را دريافت
كرد. اين روش امكان تصويربرداري از نمونههاي شفاف را فراهم مـيكنـد. بـا
استفـاده از تـداخـل نـور بـه جـاي جذب آن، نمونههاي بسيار شفاف مانند
سـلــولهــاي زنــدهي پـسـتــانــداران مـيتـواننـد بـدون نيـاز بـه
تكنيـكهـاي رنـگ آميـزي تصويربرداري شوند. تنها دو سال بعد در 1955،
Georges Nomarski تئوري مربوط به ميكروسكوپي كنتراست تداخل تفاضلي را كه
يك تكنيك تصويربرداري ديگر بر اساس تداخل است ارائه كرد.
تصويربرداري كنتراست فاز
تصويربرداري
كنتراست فاز يك روش تصويربرداري با كاربردهاي مختلف است كه از اختلاف در
شاخص انكسار مواد مختلف براي متمايزكردن ساختارهاي تحت مطالعه اسـتـفـاده
ميكند. در ميكروسكوپي نوري معمول، از كنتراست فاز براي متمايزكردن
سـاخـتـارهـاي بـا شـفـافـيـت مـشـابه استفاده ميشود كه در علوم
بيولوژيكي، پزشكي و ژئـولـوژيـكـي كـاربـرد دارد. كنتراست فاز بر اساس اين
حقيقت است كه ساختارهاي مـتـفـاوت، شـاخـصهـاي انـكـسـار متفاوتي دارند و
لذا نور را به صورتهاي مختلف منحرف كرده و گذر نور از نمونه نيز زمانهاي
تاخير متفاوت دارد. تاخير نور باعث ميشود كه برخي از موجها همفاز با بقيه
نباشند و بنابراين در يك ميكروسكوپ با مود كنتراست فاز، چشم انسان برخي از
نواحي را روشن تر يا تيره تر از بقيه ميبيند.
از كنتراست فاز به
صورت وسيعي در ميكروسكوپ نوري هم در علوم بيولوژيكي و هم علوم ژئولوژيكي
استفاده ميشود. در بيولوژي براي ديدن نمونههاي بيولوژيكي رنگ آميزي نشده
با چشم انسان از اين روش استفاده ميشود و ميتوان با اين روش، ساختارهاي
با شفافيت بسيار مشابه را از هم تفكيك كرد.
ميكروسكوپي فلئورسانس
ميكروسكوپي
بيولوژيكال مدرن بسيار وابسته به توسعهي پروبهاي فلئورسانس براي
ساختارهاي خاص درون سلول است. در مقايسه با ميكروسكوپ نوري معمولي در
ميكروسكوپي فلئورسانس، نمونه از طريق عدسي شي اي با استفاده از مجموعهي
باريكي از طول موجهاي نور روشن ميشود. اين نور با فلئوفورها در نمونه
تعامل ميكند و سپس نوري با طول موج بلندتر ساطع ميشود. اين نور ساطع شده،
تصوير را ميسازد.
از اواسط قرن بيستم رنگهاي فلئورسانت شيميائي مانند
DAPI كه با DNA تركيب مـيشـونـد، بـراي بـرچـسـب گـذاري سـاخـتارهاي خاصي
درون سلول استفاده شدند. توسعههاي جديدتر شامل ايمنوفلئورسانس كه از آنتي
باديهاي برچسب گذاري شده بــه صـورت فـلـئـورسـنـت بـراي تـشـخـيـص
پـروتـئـيـنهـاي خـاص درون يـك نـمـونـه و پروتئينهاي فلئورسنت مانند
GFP، استفاده ميكنند، هستند.
اصول عملكرد
رزولـوشـن،
كمتـريـن فـاصلـهي بيـن سـاختـارهـاي مجـاور را كـه در يـك بـزرگنمائي
مشخص، قابل تفكيك هستند مشخص ميكند. يك ميكروسكوپ با توان بالا، بازهي
ادراك بينائي يك چشم طبيعي را تا حدي بالا ميبرد كه بتواند 130 هزار خط در
هر اينچ را در فاصلهي 10 اينچي تفكيك كند. (چشم غيرمسلح ميتواند بطور
متوسط 200 خط در هـر اينـچ را در يـك فاصلهي 10 اينچي تفكيك كند.) رزولوشن
با دريچهي ديد (aperture) زياد ميشود - معياري از ماكزيمم زاويهاي كه
در آن پــرتـوهـاي نـور مـيتـواننـد تـوسـط عـدسـي اخـذ شوند.- دريچهي
ديد عددي (NA) با رابطهي زير به دست ميآيد:
كه n شاخص انكسار محيط بين عدسيهاي جلـوئـي و شيشـهي پـوشـش اسـت و u بـرابـر با نـصـــف
دريـچــهي ديــد شــي بــر حـســب زاويــه (زاويهي بين واگراترين پرتوهايي كه ميتوانند از شي براي تشكيل تصوير عبور كنند) است.
مـحــدوديــتهـايـي
روي بـازهي بـزرگنمـائـي مفيد هر objective اي وجود دارد: حد بالاي
objective برابر با 1000NA* و حد پائين آن برابر با 250NA* است .
objective با NA برابر با 25/0 ميتواند 25000 خط را در هر اينچ تفكيك
كند؛ بنابراين اگر شي تحت مشاهده، از مرتبهي 35000 خط در هر اينچ باشد،
نميتوان از اين objective استفاده كرد.
بـزرگنمـائـي مفيـد همچنين تحت
تاثير طول لولهي نوري (كه معمولا قابل تنظيم نيست)، طول لولهي مكانيكي
(كه ميتواند براي تصحيح بزرگنمائي كمي تغيير داده شود)، و عمق كانوني
(فاصلهي بين حد بالا و پائين تيزي در تصوير تشكيل شده توسط سيستم) قرار
دارد.
اجزا
تمـام ميكـروسكـوپهـاي اپتيكـال مـدرن
طـراحـي شده براي ديدن نمونهها با نور انتقالي، اجزاي پايهي يكساني در
مسير نور دارند كه به ترتيبي كه نور از آنها عبور ميكند عبارتند از (شكل
7:)
1- عدسيهاي چشمي (قطعهي چشمي( )شماره 1)
2- برجك شي اي يا nosepiece چرخنده (براي نگهداشتن چند عدسي شي اي( )شماره 2)
3objective -(شماره 3)
4- چرخ تمركز براي حركت دادن stage ( شماره 4 براي تنظيم غيردقيق و شماره 5 براي تنظيم دقيق)
5- قاب (شماره 6)
6- منبع نور، نور يا آينه (شماره 7)
7- ديافراگم و عدسي كندانسور (شماره 8)
8Stage -(براي نگهداشتن نمونه( )شماره 9)
اجـزاي
پـايهي يك ميكروسكوپ نوري شامل سيستم عدسي (قطعهي چشمي، objectiveها و
كندانسور substage)، بدنه (لولههاي مشاهده با تنظيم ديوپتر،
interpupillary adjustment, and revolving nosepiece، )stage و كنترلهاي
آن، و سيستم روشنايي (ديافراگم iris و پورت نور) در شكل 8 هم نشان داده شده
اند.
قطعهي چشمي
قطعهي چشمي يك استوانه شامل دو يا چند عـدسـي اسـت كـه وظيفـهي آن، كـانـونـي كردن تصـويـر
بـراي
چشـم اسـت. قطعهي چشمي به انتهـاي بـالايـي لـولـهي بـدنـه وارد ميشود.
اين جــزء، قــابــل تـعــويــض اســت و انــواع مـختلـف قـطـعــههــاي
چـشـمــي بــا درجــات بــزرگـنـمـائـي مـتـفـاوت قـابـل استفـاده هستنـد.
مقـاديـرمعمـول بـراي بـزرگـنـمـائـي قـطـعـات چـشمي عبارتند از
دوبـــرابـــر، 10 بـــرابـــر و 50 بــرابــر. در بــرخــي از
مـيـكـروسـكـوپهـاي با كارائي بالا، پيكربندي اپـتـيـكـال عـدسـي شي اي و
قطعهي چشمي به نـحوي تطبيق داده ميشوند كه بهترين كارائي اپتيكال ممكن به
دست آيد.
قـطـعـهي چـشـمـي عـمـدتـا بـراي بـزرگـنـمائي تـصــويــر
نـمــونـه كـه در پـشـت objective تـولـيـد ميشود استفاده ميگردد.
بزرگنمائي كلي، برابر بـا بـزرگنمـائـي objective ضـرب در بزرگنمائي
چـشـمــي اســت. قطعـهي چشمـي در طـراحـي، مثبت يا منفي است. در طراحي
مثبت، ديافراگم چشمي (ocular)، داخل سيستم عدسي در نظر گرفته نمي شود بلكه
objective، تصوير را داخل ديـافـراگم چشمي (قرار گرفته زير عدسيهاي زمينه)
و صفحهي كانوني چشمي نشان ميدهد. در طـراحـي مـنـفـي، سـيـسـتـم عـدسـي،
ديافراگم چـشـمـي را دربـرمـيگـيـرد. عـدسـيهـاي زمينه باعث ميشوند
پرتوهاي objective، همگرا شده و در ديافراگم چشمي متمركز شوند.
چهار
نوع پايه، قطعهي چشمي وجود دارند: (huygenianطراحي منفي)، Ramsden
(طراحي مـثـبت)، جبرانكننده (توان كمتر از 15 برابر، با طــراحــي
مـنـفــي و تــوان بـيـشـتـر از آن، طـراحـي مثبتاند) و زمينه-گسترده
(طراحي مثبت.)
قـطـعـــات چـشـمـــي Huygenian مـعـمــولا بــا
objectiveهـاي بـي رنگ يا semiapochromatic با بزرگنمائي 20 برابر يا كمتر
استفاده ميشوند. مدلهاي بهبود داده شده از چشميهاي Ramsden را ميتوان
با objective ايهـاي بـي رنـگ بـا بـزرگنمـائـي 17 بـرابـر يـا كمتـر و NA
بـرابـر بـا 65/0 استفـاده نمـود. چشميهاي جبرانكننده براي استفاده با
شي ايهاي apochromatic طراحي شدهاند اما هـمـچـنـين ميتوان از آنها
براي semiapochromates استفاده كرد. بازهي بزرگنمائي قطعهي چشمي، از 5
برابر تا 30 برابر است و مقدار معمول آن ده برابر است. معمولا
پاتولوژيستها از قطعههاي چشمي با ميدان ديد وسيع استفاده ميكنند، به اين
دليل كه زمينه ديد مسطح و بزرگي براي بررسي نمونههاي بزرگ از بافت دارند.
برجك شي اي يا nosepiece گردنده
اين قسمت مجموعهي عدسيهاي شي اي را نگه ميدارد و به كاربر امكان سوئيچ كردن بين objectiveهاي مختلف را ميدهد.
Objective
در
انتهاي پاييني يك ميكروسكوپ تركيبي يك يا چند عدسي شي اي وجود دارد كه نور
را از نمونه جمع ميكند. objective معمولا استوانه اي است كه يك عدسي
تركيبي چندجزئي يا تك شيشه اي را دربرمي گيرد. معمولا سه عدسي شي اي به يك
nosepiece دايره اي پيچ شده اند و ميتوان آنها را چرخانده و يكي را انتخاب
نمود. اين پيكربندي به صورت parfocal طراحي شده است؛ يعني زماني كه از يك
عدسي به عدسي ديگر سوئيچ مـيشـود، نمونه همچنان در كانون باقي ميماند.
Objectiveهاي ميكروسكوپ با دو پارامتر بزرگنمائي و NA مشخص ميشود.
بزرگنمائي معمولا از 5 برابر تا 100 برابر و NA از 14/0 تـا 7/0 اسـت
كـه بـه ترتيب متناظر يا طولهاي كانوني 2 تا 40 ميلي متر است. عدسيهاي شي
اي با بزرگنمائيهاي بيشتر، NA بالاتر و عمق زمينه كمتري در تصوير حاصل
دارند.
سه نوع پايهي objective عبارتند از بي رنگ، فلوريت و
apochromatic. نوع بي رنگ، بدون اين كه نور را به رنگهاي تشكيل دهندهي آن
تجزيه كنند آن را منكسر ميكند. نوع فـلــوريــت درجــهي تـصـحـيــح
بــالاتــري نـسـبـت بـه بـي رنـگهـا فـراهـم مـيكـنـنـد. نـوع
apochromatic براي سه طول موج مختلف نور و نيز براي انحرافات كروي تصحيح
ميشوند.
بـرخـي از objectiveهـا، بـراي استفـاده بـا شيشـهي پـوشـش و
برخي براي استفاده با نمـونـههـاي پـوشيده نشده تصحيح ميشوند. نوع اول
نياز به نوع خاصي از شيشهي پوشش (با ضخامت 17/0 تا 19/0 ميليمتر) دارند؛
تمام objectiveهاي با توان متوسط تا بالا براي اين بازه از ضخامت تصحيح
ميشوند. اين تصحيح همراه با NA، بزرگنمائي و طول لوله روي objective نوشته
ميشوند (شكل 9.)
objective غوطه ور در روغن
برخي از ميكروسكوپها از objectiveهاي غوطهور در آب يا روغن براي رسيدن به رزولوشن بالاتر در
بزرگنماييهاي
بالا استفاده ميكنند (شكل 10NA .) به بزرگي 6/1 ميتواند به دست آيد. هر
چه اين پارامتر بزرگتر باشد نور بيشتري جمع شده و امكان مشـاهـدهي دقيـق
جـزئيـات كـوچكتر فراهم ميشود. يك عدسي غوطه ور در روغن معمولا بزرگنمائي
40 تا 100 دارد.
يك قطره روغن روي شيشهي پوشش يا نمونه قرار داده
ميشود. بعد از متمركز كردن نمونه در زير objective با توان كم، عدسي غوطه
ور در روغن به محل جابجا شده و با روغن تماس پيدا ميكند و ميتواند شيشهي
پوشش را لمس كند. در برخي از طراحيها بـراي اجتنـاب از خـراشيـده شده
عدسي غوطه ور در روغن، عدسي با فنر بارگذاري مـيشـود. استفـاده از شيشـهي
پـوشـش بـا ضخـامـت اشتباه يا نمونههاي بدون پوشش مـــيتـــوانـــد
مـنـجـــر بــه خـطــا در objectiveهــاي غـوطـهور در روغـن شـود. ايـن
objectiveهـا به خاطر رزولوشن بالائي كه دارند بايد فقط براي محيطهاي با
بزرگنمائي زياد استفاده شوند. NA يك هدف غوطه ور در آب تنها زماني معتبر
است كه در تماس روغني با اسلايد باشد.
كندانسور
كندانسور عدسي طراحي شده براي متمركز كردن نور منبع روشنائي روي نمونه است و البته
مـيتـوانـد شـامل مشخصههاي ديگر مانند يك ديافراگم و/يا فيلترها براي تنظيم كيفيت و شدت روشنائي باشد.
كــنــــدانــســــور
substage نــــور مـنـبـــع را روي صفحهي نمونه، متمركز ميكند و ميزان
كافي نــور هـمـگــراشـده، بـراي مـيـكـروسـكـوپ بـراي رسيـدن بـه رزولوشن
كامل فراهم ميكند. سه نـــوع پـــايـــهي كـنـــدانـســـور
عـبـــارتـنـــد از Abbe، اكــــــــرومــــــــاتــــيـــــــك و
aplanatic (شــــكـــــــل 11.) ميكـروسكـوپهـاي روتيـن آزمـايشگـاهـي
عموما مجهـز بـه كندانسور Abbe هستند كه هيچ نوع انحرافي را تصحيح نمي كند.
يك سيستم عدسي كه براي انحرافات كروي، تصحيح نشده باشد، نـقـطــهي
كــانــونــي مـشـتـركـي فـراهـم نمـي كنـد. كندانسورهاي آكروماتيك، خطاهاي
رنگي را كه در اثر انكسار نور سفيد به پرتوهاي قرمز و بنفـش ايجاد
ميشوند، تصحيح ميكنند و انحرافات كروي را هم تا حدي تصحيح ميكنند.
كندانسورهاي aplanatic انحرافات كروي را به صورت كامل تصحيح ميكنند اما
هيچ خطاي رنگي اي را تصحيح نمي كنند.
لولههاي مشاهدهي ميكروسكوپ، يك
تنظيم ديوپتر دارند كه عدسيها را به بينائي اپراتور تطبيق ميدهد و همچنين
يك تنظيم بين دو عدسي (interpupillary)دارند كه قطعهي چشمي را براي تطبيق
با فاصلهي بين چشمان اپراتور اصلاح ميكند. Stage كه اسلايد نمونه روي آن
قرار ميگيرد، در مركز ميكروسكوپ است و ميتواند در جهات X و Y و Z حركت
داده شود. بسياري از stageها ورنيه هائي دارند كه به تعيين مكانهاي خاصي
روي اسلايد كمك ميكند. بدنهي ميكروسكوپ نيز يك قطعه (nosepiece) دارد
كــه objective روي آن ســوار مــيشــونــد و مـعـمــولا چـهــار يــا
پـنـج objective را نگهميدارند.
منبع نور
انواع
مختلفي از منابع نور ميتوانند استفاده شوند كه ساده ترين آنها، هدايت
كردن روشنائي روز از طريق يك آينه است. اغلب ميكروسكوپها، منبع نور قابل
كنترل و قابل تنظيم خود را دارند كه معمولا يك لامپ هالوژن است. البته
استفاده از LEDها و ليزرها به تدريج مرسومتر ميشود.
پذيرفته شده
ترين نوع سيستم روشنائي از روش Koehler استفاده ميكند كه نياز به منبع نور
(اغلب در پورت نور قرار ميگيرد، شكل 8)، كندانسور لامپ، ديافراگم عنبيه،
كندانسور substage تصحيح شده و يك آينه يا منشور نقره پوش دارد. منبع نوري
براي روشنائي Koehler نياز به همگن بودن ندارد: تقريبا هر لامپ خوبي، مناسب
است، به ويژه اگر با عدسي داخلي متراكم كننده و ديافراگمهاي عنبيه كه به
صورت خاص براي اين روش طراحي شده اند تصحيح شده باشد. اغلب از منبع نوري با
فيلمان تنگستن هالوژن استفاده ميشود. اغلب منابع نوري رئوستاهائي براي
تنظيم شدت روشنائي دارند.
چرخهاي تمركز
چرخهاي
تنظيم، stage را با تنظيمات جداگانه براي كانوني كردن دقيق و كلي، به بالا
و پـائـيـن حـركـت مـيدهـنـد. كـنـتـرلهـاي مـشـابهي ميكروسكوپ را به
نمونههاي با ضخامتهاي متفاوت تنظيم ميكنند.
قاب
كل
چيدمان اپتيكال به يك بازوي محكم وصل است كه خود به پايهي U شكل مقاوم
براي فراهم كردن استحكام موردنياز متصل است. ممكن است زاويهي بازو قابل
تنظيم باشد كه در اين صورت زاويهي ديد هم قابل تنظيم خواهد بود.
قاب،
يك نقطهي اتكا براي كنترلهاي متفاوت ميكروسكوپ فراهم ميكند؛ اين
كنترلها به صورت طبيعي شامل يك چرخ دندانه دار بزرگ براي تنظيم كلي تمركز و
يك چرخ دندانه دار كوچكتر براي كنترل ظريف آن است. ديگر كنترلهاي ممكن،
كـنـتــرل لامــپ و/يــا كـنـتــرلهــايــي بــراي تـنظيـم كندانسور
هستند.
Stage
صفحه
اي است در زير هدف كه نمونه را نگه ميدارد. در مركز آن سوراخي است كه از
طريق آن نور براي روشن كردن نمونه عبور ميكند. Stage مـعـمــولا
بــازوهــايــي بــراي نـگـهــداشـتـن اسلايدها دارد.
در
بزرگنمائيهاي بيش از 100 برابر حركت دادن اسـلايـد بـا دسـت امكان پذير
نيست. يك stage مكانيكي كه معمولا در ميكروسكوپهاي بــا قـيـمــت
مـتــوســط بــه بـالا وجـود دارد امكـان حركات ريز اسلايد را از طريق
كليدهاي كنترل كه نمونه و اسلايد را به مقدار موردنظر حركت ميدهند فراهم
ميكند. اگر يك ميكروسكوپ از اول stage مكانيكي نداشته باشد، ميتوان اين
مشخصه را به آن اضافه كرد.
تـمـام stageهـا براي متمركزكردن به سمت بالا
و پايين حركت ميكنند؛ در مورد stageهاي مكانيكي اسلايدها در دو محور افقي
هم براي تـعـيـيـن مـوقـعـيـت نـمونه و بررسي جزئيات آن حركت ميكنند.
كانوني
كردن در بزرگنمائيهاي كوچكتر شـروع ميشود تا نمونه توسط كاربر در مركز
stage قرار بگيرد. براي انتقال به بزرگنمائيهاي بالاتر نياز است كه stage
به صورت عمودي بالا آورده شــــود تــــا كــــانــــونـــي كـــردن،
مــجـــدداً در بـزرگنمـائي بالاتر انجام شود. همچنين ممكن است نياز به
تنظيم جزئي موقعيت افقي نمونه باشد.
با توجه به مشكل بودن آماده سازي
نمونهها و قراردادن آنها روي اسلايدها، بهتر است براي كـودكـان از
اسلايدهاي آماده كه در مركز قرار گـرفتـه انـد و بدون توجه به سطح تمركز
مورد استفـاده بـه راحتـي كـانـونـي مـيشـوند، استفاده شود.
بزرگنمايي
بزرگنمائي
يك ميكروسكوپ نوري تركيبي حــاصـلـضــرب بــزرگـنمـائـي قطعـات چشمـي و
عدسي شي اي است. ماكزيمم بزرگنمائيهاي معمول عدسيهاي چشمي و شي اي به
ترتيب 10 برابر و 100 برابر هستند كه بزرگنمائي كلي برابر 1000 به دست
ميدهند.
بزرگنمايي و ميكروگرافها
در
هنگام استفاده از دوربين براي گرفتن يك ميكروگراف، اندازهي تصوير بايد در
بـزرگنمـائـي مـوثـر تصـويـر درنظـر گـرفته شود. اين موضوع مستقل از اين
است كه آيا ميكروگراف، چاپ شده است يا اين كه به صورت ديجيتال روي صفحهي
كامپيوتر نمايش داده ميشود.
مـحــاسـبــه در مــورد دوربـيــنهــاي
فـيـلــم عـكــاسـي، سـاده اسـت؛ بـزرگنمـائـي نهـايـي حاصلضرب بزرگنمائي
عدسي شي اي، بزرگنمائي دوربين و فاكتور بزرگنمائي چاپ فيلم نسبت به نگاتيو
است. مقدار معمول فاكتور بزرگنمائي، حدود 5 برابر (براي فيلم 35 ميلي متري و
چاپ 15 در 10 سانتيمتري) است.
در مورد دوربينهاي ديجيتال، اندازهي
پيكسلها در دتكتور CCD يا CMOS و اندازهي پـيـكـسـلها روي صفحه بايد
معلوم باشند. در اين حال ميتوان فاكتور بزرگنمائي از دتكتور به پيكسلهاي
روي صفحه را محاسبه كرد. مشابه حالت قبل، بزرگنمائي نهائي برابر با حاصلضرب
بزرگنمائي عدسي شي اي در بزرگنمائي اپتيك دوربين و فاكتور بزرگنمائي است.
عملكرد
اجــزاي نـوري يـك مـيـكـروسـكـوپ مـدرن بـسـيـار پـيـچـيـده انـد و بـراي ايـن كـه يـك ميكروسكوپ به
خوبي
كار كند بايد كل مسير نوري با صحت بالائي تنظيم و كنترل شود. با اين وجود
اصول عملكردي پايهي ميكروسكوپ بسيار ساده اند (شكل 12:)
عدسي شي اي در
ساده ترين حالت يك شيشهي با بزرگنمائي بالا يعني يك عدسي با فاصلهي
كانوني بسيار كوتاه است. اين عدسي بسيار نزديك به نمونهي در حال بررسي
قرار ميگيرد و به اين ترتيب تصوير بزرگنمائي شده اي از شي تشكيل ميشود.
اين تصوير معكوس شده و ميتوان آن را با برداشتن قطعهي چشمي و قرار دادن يك
كاغذ tracing روي انتهاي لوله آن راديد. با كانوني كردن دقيق يك نمونهي
روشن ميتوان يك تصوير بسيار بزرگ را ديد.
در اغلب ميكروسكوپها
قطعهي چشمي يك عدسي مركب است يعني يك عدسي نزديك به جلو و يكي نزديك به
انتهاي لولهي قطعهي چشمي قرار دارد. در بسياري از طراحيها يك تصوير
مجازي بين دو عدسي قطعهي چشمي، كانوني ميشود به اين صورت كه عدسي اول،
تصويرواقعي را كانوني ميكند و عدسي دوم، چشم را قادر ميسازد كه روي تصوير
مجازي تمركز كند.
در تمام ميكروسكوپها هدف اين است كه با براي ديدن
تصوير، چشم در بي نهايت تـمــركــز كـنــد. ســردردو خـسـتـگــي
چـشــمهــا كــه مـمكـن اسـت بعـد از استفـاده از يـك مـيـكـروسـكـوپ رخ
دهـد مـعـمـولا نـشـانـه اين است كه چشم مجبور شده كه به جاي بينهايت، در
يك فاصلهي نزديك تمركز كند.
اصل پايهي ميكروسكوپ اين است كه يك عدسي
شي اي با فاصلهي كانوني بسيار كوتاه (اغلب در حد چند ميلي متر) براي تشكيل
يك تصوير واقعي با بزرگنمائي بالا از شي استفاده ميشود. امروزه در عمل
براي بزرگنمائي از دو عدسي استفاده ميشود: شي اي كه تصويري در بي نهايت
ايجاد ميكند و يك عدسي ضعيف تر كه يك تصوير واقعي در صفحهي كانوني خود
تشكيل ميدهد.
مسائل گزارش شده
وجود
حبابهاي هوا در روغن و نيز وجود گرد و غبار، روغن يا اثر انگشت روي سطح
يـك جـزء نوري ميتوانند منجر به توليد تصاوير مغتش شوند. گرد و غبار به
راحتي شـيشهي نرمي كه در عدسيهاي ميكروسكوپ استفاده ميشود را خراش
ميدهد. هـمـچـنـيـن اسـتـفـاده از حلالهاي نامناسب ميتواند پيوستگي
المانهاي يك عدسي شــياي را از بـيـن ببـرد و تميـزكـردن بـا ابـزار يـا
حـلالهـاي نـامـنـاسب نه تنها گرد و غباررا كم نميكند بلكه آن را افزايش
ميدهد.
بـراي اصـلاح انـحـرافـات، تـجـهيزات بايد به صـورت مـنـاسـب
اسـتـفـاده شـونـد. زماني كه از objectiveهــاي طــراحـي شـده بـراي
اسـلايـدهـا استفـاده مـيشود، بايد ورقههاي پوشش روي آنها قرار داده
شوند. استفاده از شيشهي پوشش با ضخامت اشتباه تاثير منفي دارد، البته
ميتوان ايـن مـوضوع را با تنظيم طول لولهي مكانيكي جـبــران كــرد.
تـنظيـم بيـش از حـد ديـافـراگـم در مـوقـعـيـت به سمت پائين، منجر به
انكسار نور مــيشـود. ارتـعـاشـات اجـزاي مـيـكـروسـكـوپ، مشكلاتي در
فتوميكروگرافي ايجاد ميكنند اما ميتوان اين موضوع را با استفاده از صفحات
يا جداول ضدارتعاش حداقل كرد.
در مـيـكــروسـكــوپــي
فـلـئــورســانــس نـيــاز بــه احتياطات خاصي است. زمينه تابش در نور UV
نبايد هرگز بدون فيلتر ديده شود چرا كه ميتواند موجب آسيب دائمي به چشم
شود.
استفادهي مكرر از ميكروسكوپهايي كه به صورت نامناسب طراحي يا
پيكربندي شده اند مــيتــوانــد احـتـمـال ايجـاد اختـلالات تـرومـا را
افـزايـش دهد. در برخي از ميكروسكوپهاي قديمي تر، كاربر مجبور است كه روي
قطعهي چشمي خم شود يا اين كه مچ دست را در يك زاويهي غيرطبيعي خم كند.
تنظيم كردن فضاي كـاري دسـتـگـاه بـراي هـر فـرد مـيتواند مانع از ناراحتي
شخص شده يا آن را مينيمم كند- كاربر بايد در حالي كه پشتش در موقعيت
مناسبي قرار گرفته است بنشيند، شانهها را به صورت موازي با هم قرار دهد و
مطمئن باشد كه تصاوير تا حد امكان روشن و واضح اند. نشستن در موقعيتي كـه
پـشت، صاف و بدون كشش است و ديدن نـمـونـه در حـالـي كـه قـطعهي چشمي در
زاويه مناسب قرار گرفته است، تضمين ميكند كه سر و گردن در موقعيت درستي
قرار گرفته اند. ديدن تصاوير تيز و واضح، خستگي چشم را كاهش ميدهد.
منبع: نشریه مهندسی پزشکی شماره ۱۴۶، مهندس فاطمه یاوری