پزشکی بالینی

كروماتوگرافي، روشي براي جداسازي مواد

جداسازي مواد مختلف از يكديگر در آزمايشگاه‌هاي شيمي و به ‌ويژه بيوشيمي همواره يكي از دغدغه‌هاي مهم پژوهشگران بوده است. امروزه كروماتوگرافي به عنوان يكي از پر كاربردترين روش‌هاي جداسازي و تخليص مواد مورد نظر، از ميان اجزاي بي‌شمار يك نمونه شناخته شده است. فرايند كروماتوگرافي روشي است براي جداسازي اجزاي يك مخلوط، به ‌وسيله پخش اين اجزا در بين فازهاي متحرك و ساكن، در طول زمان. عبارت كروماتوگرافي از دو واژه كروما، به معناي ‌<رنگ> و گرافين به ‌معني ‌<نوشتن> گرفته شده است.
از مزاياي اين روش مي‌توان به كوتاهي زمان جداسازي و هزينه پايين اشاره  كرد. همچنين، مقدار نمونه لازم براي جداسازي در اين فرايند، در مقايسه با ساير روش‌ها كمتر است. اين روش براي نخستين بار در سال 1903، توسط ميخائيل سوئت، به منظور جداسازي رنگدانه‌هاي گياهي درون يك ستون آهكي مورد استفاده قرار گرفت و در طول سال‌هاي 1937 تا 1972 پيشرفت چشمگيري داشت؛ به گونه‌اي كه توسعه روش‌هاي آن در سال 1954، جايزه نوبل را براي مارتين و سينگ به ارمغان آورد.

كروماتوگرافي در واقع روشي فيزيكي به منظور جداسازي است، كه در آن مواد مورد نظر براي تفكيك ، محيطي بي‌حركت پخش مي‌شوند. اين فاز بي‌حركت، به <فاز ساكن> معروف است؛ در حاليكه فاز ديگر، يعني <فاز متحرك>، در امتداد يك مسير معين جاري مي‌شود. فاز متحرك، در واقع همان حلال و فاز ساكن شامل ستون‌هايي حاوي ماده مورد تجزيه است. فرايند كروماتوگرافي در اثر اختلاف ميان ضريب‌هاي پخش هر يك از اجزاي نمونه در ميان اين دو فاز اتفاق مي‌افتد.

دسته‌بندي روش‌هاي كروماتوگرافي
روش‌هاي مختلف كروماتوگرافي از جنبه‌هاي مختلف دسته‌بندي مي‌شوند. در يكي از اين تقسيم‌بندي‌ها روش‌هاي كروماتوگرافي بر مبناي نوع مادهِ تشكيل‌دهنده فازهاي ساكن و متحرك در چهار دسته مجزا قرار مي‌گيرند. به گونه‌اي كه جزء اول نام روش، نمايان‌گر نوع فاز متحرك و جزء دوم آن نماينده فاز ساكن است. اين چهار دسته عبارتند از:
1-كروماتوگرافي مايع- جامد (LSC): كه خود شامل چهار روش كروماتوگرافي ‌جذب سطحي، لايه نازك، ‌تبادل يوني و ژلي است
2-كروماتوگرافي مايع- مايع )LLC): روش‌هاي كروماتوگرافي كاغذي و ‌تقسيمي ‌در اين بخش قرار مي‌گيرند.
3-كروماتوگرافي گاز- جامد )GSC): از اين روش براي خالص‌سازي گازهاي فرار استفاده مي‌شود.
4-كروماتوگرافي گاز- مايع (GLC): انواع روش‌هاي كروماتوگرافي ستوني در اين دسته قرار مي‌گيرند.
در ادامه به توضيح هر يك از روش‌هاي ذكر شده مي‌پردازيم:

كروماتوگرافي جذب سطحي
در اين نوع كروماتوگرافي كه عمدتا براي تركيبات قطبي و غير يوني مطرح مي‌شود، جداسازي بر مبناي اختلاف ميزان جذب سطحي مواد مختلف در فازهاي ساكن و متحرك، صورت مي‌پذيرد. متداول‌ترين موادي كه به عنوان جاذب سطحي (فاز ساكن)، استفاده مي‌شوند ژل‌هاي آلومينا و سيليكا هستند و فاز متحرك نيز حلالي مانند هگزان است. بر‌هم‌كنش‌فاز ساكن و مولكول‌هاي حل‌شونده به دليل حضور گروه‌هاي هيدروكسيل روي سطح جاذب صورت مي‌گيرد. مولكول‌هايي قطبي‌تر، بيشتر جذب شده و در نتيجه كند‌تر شسته مي‌شوند و همين موضوع مبناي تفكيك اجزاي نمونه خواهد بود.

كروماتوگرافي لايه نازك
در اين روش، فاز ساكن لايهِ‌نازكي از جاذبي سطحي (عموما ژل سيليكا   يا آلومينا) است كه بر روي صفحه‌اي نازك كشيده شده است  و فاز متحرك، عبارت است از مايع ظهور كه در مسير حركت خود از ميان فاز ساكن نمونه را نيز حمل مي‌كند. اجزاي نمونه، بر اساس ميزان جذب در فاز ساكن و ميزان انحلال‌پذيري در فاز متحرك جداسازي مي‌شوند.

كروماتوگرافي تبادل يوني
در اين روش، يون‌هاي يك محلول الكتروليت (فاز متحرك)، به عنوان فاز ساكن با رزين مبادله‌كننده يوني در تماس قرار مي‌گيرند. رزين، يك پليمر انحلال ناپذير، شامل شبكه‌اي حامل يون‌هاي ثابت و متحرك (فعال) است. يون‌هاي متحرك رزين، با پيوندي ضعيف به شبكه متصل هستند. رزين‌ها به دو گروه كاتيوني و آنيوني تقسيم مي‌شوند. در محيط آبي، يون‌هاي متحرك داخل شبكه كم وبيش به صورت آزادانه حركت مي‌كنند و يون‌‌‌هاي موجود در محلول الكتروليت جايگزين آن‌ها مي‌شوند. مكانيزم جداسازي در كروماتوگرافي تبادل يوني همانند روش جذب سطحي است، با اين تفاوت كه در اين روش به جاي ژل‌هاي آلومينا يا سيليكا، از رزين كروماتوگرافي استفاده مي‌شود.

كروماتوگرافي ژلي
فاز ساكن در اين روش، به صورت فضاي پليمري متخلخلي شامل ذرات اسفنجي است. حفره‌هاي اين فضاي پليمري كاملا با ژلي به عنوان فاز متحرك، پوشش داده شده‌اند. عمل تفكيك بر مبناي قطر حفره‌ها صورت مي‌گيرد. به عبارت ديگر، بر خلاف مولكول‌هاي كوچك، مولكول‌هايي كه ابعادشان از حدي مشخص بيشتر باشد قادر به نفوذ در ژل نيستند؛ نتيجه اين فرايند غربال‌گري، جداسازي مولكول‌ها خواهد بود.

كروماتوگرافي كاغذي 
در اين روش، از كاغذ صافي به عنوان تكيه‌گاهي ثابت براي نمونه استفاده مي‌شود. در كروماتوگرافي كاغذي، فاز ساكن معمولا آب است كه جذب فيبر‌هاي سلولز موجود در كاغذ مي‌شود. فاز متحرك، شامل حلالي آلي است كه  از نمونه موجود بر روي كاغذ عبور مي‌كند. جداسازي اجزاي مخلوط از يكديگر به ضريب تفكيك آن‌ها در حلال بستگي دارد. 

كروماتوگرافي تقسيمي
اين روش، شامل تكيه‌گاهي ثابت از جنس سلولز يا سيليكا است كه توسط لايه مايعي به عنوان فاز ساكن پوشش داده مي‌شود. فاز متحرك نيز مي‌تواند هر مايع انحلال ناپذيري در فاز ساكن باشد. جداسازي اجزاي نمونه بر مبناي سرعت حركت آن‌ها در فاز ساكن صورت مي‌پذيرد؛ كه از اين جهت بسيار شبيه كروماتوگرافي جذب سطحي است.

كروماتوگرافي گاز- جامد
 ‌اين روش عمدتا براي جداسازي اجزاي مخلوط‌هاي گازي به كار مي‌رود.

كروماتوگرافي ستوني
در اين روش نيز، فاز ساكن از جنس سيليكا يا آلومينا است كه با حلال مورد استفاده به عنوان فاز متحرك تركيب مي‌شود تا محلول آبكي سفيد رنگي حاصل شود. ميزان كشش عناصر مختلف موجود در داخل نمونه در فازهاي ساكن و متحرك، متفاوت بوده و در نتيجه، اين عناصر در زمان‌هاي متفاوتي از فاز ساكن خارج مي‌شوند. موادي با قطبيت بالا در نمونه بيشتر تحت كشش سطحي فاز ساكن قرار گرفته و به آرامي ‌از ستون شسته مي‌شوند. در مقابل، موادي كه قطبيت آن‌ها در نمونه كمتر است، كمتر تحت تاثير كشش سطحي از سوي فاز ساكن قرار گرفته و سريعا توسط فاز متحرك، در ميان ستون به جلو رانده مي‌شوند. 
در ابتدا دهانه‌ستون را با لايه‌اي نازك از ماسه (جهت ايجاد بستري يكنواخت براي فاز ساكن)، كه بين دو لايه از جنس پشم‌شيشه (به منظور جلوگيري از آلوده شدن محصولات) قرار گرفته پوشش داده، سپس فاز ساكن را درون آن مي‌ريزيم. از آن‌جائيكه ژل‌هاي آلومينا و سيليكا كاملا غليظ و چگال هستند، اگر نيروي گرانش تنها نيروي كششي فاز متحرك در ميان ژل باشد، پيشرفت فرايند بسيار كند خواهد بود. به منظور تسريع آن، مي‌توان از اعمال گازي با فشار بالا در قسمت فوقاني ستون، و يا ايجاد خلاء در قسمت انتهايي آن (بوسيله سرنگ) استفاده كرد. اين روش كروماتوگرافي ستوني آني ‌ناميده مي‌شود.

برخي كاربردهاي كروماتوگرافي
همان‌گونه كه پيش‌تر ذكر شد، استفاده از كروماتوگرافي در بسياري از زمينه‌هاي زندگي، از جداسازي آلاينده ‌هاي محيطي گرفته تا شناسايي گياهان دارويي و داروسازي كاربرد گسترده‌اي دارد. به‌علاوه استفاده از اين روش در اكثر آزمايشگاه‌هاي شيمي و بيوشيمي امري كاملا متداول است. از ميان كاربردهاي گسترده آزمايشگاهي اين روش مي‌توان به موارد زير اشاره كرد:
‌تعيين وزن مولكولي پروتئين‌ها و پلي‌ساكاريد‌ها، نمك‌زدايي از مواد كلوئيدي، جداسازي اسيدهاي آمينه از پپتيدها و پروتئين‌ها، تفكيك ميوگلوبين و هموگلوبين ‌و خالص‌سازي آنزيم‌ها ‌كه به‌روش كروماتوگرافي ژلي انجام مي‌شوند. 
‌نرم كردن آب و زدودن مواد معدني از آن، خنثي سازي اسيديته مواد ‌و تفكيك الكتروليت‌ها از غير الكتروليت ها، كه همگي از طريق كروماتوگرافي تبادل يوني انجام‌پذير هستند.

منبع: نشریه مهندسی پزشکی شماره ۱۱۱