روش125- وسترن بلاتينگ
كاربردهاي روش الكتروفورز بر روي ژل در ابتدا محدود به موارد خاصي بود؛ زيرا دسترسي كاوشگرهاي (پروب‌هاي) ملكولي به پروتئين‌هاي جداسازي شده در بستر ژل بسيار دشوار بود. سرانجام Towbin و همكاران در سال 1979، روشي را ابداع كردند كه توانايي انتقال پروتئين‌ها از ژل به غشاي جاذب را مي‌داد. اين روش به وسترن بلاتينگ يا بلاتينگ پروتئين معروف شد. اين تكنيك ابتدا در آزمايشگاه George Stark در استانفورد ابداع شد. نام وسترن بلات از جانب W.Neal Burnette به اين تكنيك اختصاص يافت و در حقيقت بيشتر يك شوخي و مزاح با اسم تكنيك ساترن بلات (Southern blot) بود كه به منظور بررسي DNA، پيشتر توسط Edwin Southern نامگذاري شده بود. تكنيك بررسي RNA را نورترن بلات (Northern blot) مي‌نامند.
سـاده‌تـريـن روش پـروتـئـيـن بـلاتـيـنـگ، دات بــلاتـيـنــگ نــامـيــده مــي‌شــود. در روش مــذبـور مولكول‌هاي پروتئيني محلول در نمونه به كمك پي پت متغير يا سرنگ هاميلتون، به‌طور مستقيم بـه غـشـا مـنـتـقـل مـي‌‌شـوند. با انجام اين روش، اطلاعاتي كيفي در مورد بروز پروتئين به‌دست مي‌آيد.
روش ديـگــر كــه پـيـچـيــده‌تـر اسـت، وسـتـرن بـلاتينـگ نـاميـده مـي‌شود كه شامل جداسازي مخلوط پروتئيني بر روي ژل و سپس انتقال آن‌ها به يك غشاي مناسب است. در اين روش يك مـلـكــول پــروتـئـيـنـي از طـريـق ميـانكنـش بـا يـك آنـتــي‌بــادي اخـتـصــاصــي نـشــانــدار، شـنــاســايـي مي‌شود. در اين تكنيك، منبع توليد پروتئين كه in vitro و يا in vivo باشد، تفاوتي نمي‌كند. منبع نمونه‌ها هم ممكن است از بافت كامل يا كشت سلولي گرفته شده باشند. در اغلب موارد، بايد با اســتـــفــــاده از blender، homogenizer و يـــــا sonication، بـــافـــت مـــورد نــظـــر را خـــرد كــرد. سلول‌ها نيز ممكن است كه لازم باشد تا با يكي از وسـايـل بالا، آن‌ها را خرد كرد. لازم به ذكر اسـت كـه بـاكـتـري ها، ويروس‌ها و نمونه‌هاي محيطي نيز مي‌توانند منبع پروتئين بوده و وسترن بلات تنها محدود به بررسي مطالعات سلولي نمي‌شود.
از آنجائي‌كه غالبا وسترن بلاتينگ را به كمك اتصال آنتي بادي ها مورد تجزيه و تحليل قرار مي دهند، به آن ايمونو بلاتينگ نيز گفته مي شود. وسترن بلات يكي از روش هاي ايمونواسي است كه براي آشكار سازي پروتئين در بافت ها و مايعات بدن به كار مي رود. اين روش، تركيبي از الكتروفورز و انتقال پروتئين ها به يك فاز جامد است.
با اين روش مي‌توان اطلاعاتي در مورد خصوصيات مختلف آنتي‌ژن‌هاي پروتئيني شامل وجود و مقدار آنتي‌ژن، وزن ملكولي پروتئين، ايزوفرم‌ها و محصولات شكسته شده آن و كارايي روش استخراج آنتي‌ژن به دست آورد.
وسترن بلات به شما مي‌گويد كه چه مقدار پروتئين در سلول وجود دارد. چنانچه پروتئين به سرعت تجزيه شود، تكنيك وسترن بلات قادر به تشخيص آن نخواهد بود.
در آزمايشگاه‌هاي تشخيص طبي از وسترن بلاتينگ به منظور بررسي و تاييد حضور يك آنتي بادي در بدن و تشخيص بيماري‌هاي عفوني و انگلي، بيماري‌هاي خود ايمني و آلرژي استفاده مي‌شود. همچنين از اين روش به عنوان آزمايش تاييدي براي تشخيص عفونت HIV و 1HTLV- پس از نتايج مثبت اين آزمايش‌ها با روش اليزا و انسفالوپاتي اسفنجي گاوي و همچنين بيماري Lyme، استفاده مي‌شود.
براي آناليز پروتئين‌هاي جدا شده با الكتروفورز و تشخيص پروتئين مورد نظر از واكنش آن با آنتي بادي اختصاصي استفاده مي‌شود. اين واكنش نمي‌تواند بر روي ماتريس الكتروفورز انجام شود. براي اين كار مي‌توان قسمتي از ژل را كه حدس زده مي‌شود نوار پروتئين مورد نظر در آن قرار دارد، برش زده و نمونه پروتئيني را از آن به داخل يك بافر انتقال داد. اين روش سخت و وقت گير است. روش كارآمدي كه مورد استفاده قرار مي‌گيرد روش وسترن بلاتينگ است. در اين روش ملكول‌هاي جدا شده توسط ژل الكتروفورز از ژل به فيلترهاي غشايي انتقال داده مي‌شوند. اين ملكول‌ها در سطح غشا فيلتري در همان محلي كه منتقل شده‌اند پايدار باقي مي‌مانند. در اين حال به سهـولـت براي انجام واكنش با آنتي بادي‌هاي اختصاصي آمادگي دارند. غشا مورد استفاده در روش وسترن بلاتينگ معمولا نيترو سلولزي و يا پلي وينيل دي فلورايد (PVDF) (Polyvinylidene difluride) است. بايد توجه داشت كه نبايد ميان ژل و غشا، حباب هوا ايجاد شود. زيرا در اين صورت، پروتئين مورد نظر از ژل به غشا انتقال پيدا نمي‌كند.
انتقال پروتئين از ژل به غشا توسط الكتروفورز معكوس و در طول 30 دقيقه تا 2 سـاعـت صـورت مـي‌گيـرد. ايـن كـار تـوسط دو روش مرطوب (Wet) و نيمه خشك (Semi dry) صورت مي‌گيرد. در روش مرطوب ژل الكتروفورز در يك قاب در كنار غشا و در ظرفي حاوي بافر بين دو الكترود قرار مي‌گيرد. اعمال جريان الكتريكي و برقراري اختـلاف پتانسيل موجب مهاجرت يون‌ها از ژل به غشا خواهد شد. در روش نيمه خشك ظرف بافر با فيلترهاي كاغذي آغشته به بافر جايگزين مي‌شود. مراحل انجام وسترن بلاتينگ در تصوير1 به صورت كلي نشان داده شده است.
بعـد از تثبيـت پروتئين‌ها بر روي غشا براي حصول اطمينان از كامل بودن انتقال مـي‌تـوان از روش‌هـاي رنـگ‌آميـزي غير اختصاصي استفاده كرد. در عين حال آنتي بادي‌هاي اختصاصي قادر به نشان دادن استانداردها از جمله ماركرهاي وزن ملكولي روي ژل نيستند. بنابراين در كنار تشخيص با آنتي بادي مي‌توان براي آناليز كامل از يك روش رنگ آميزي مانند Ponceau S استفاده كرد. جاي نوارهاي رنگ آميزي شده با Ponceau S با مداد بر روي غشا علامت گذاري مي‌شود. چرا كه اين رنگ ماندگار نيست و در طي تشخيص با آنتي‌بادي شسته مي‌شود. لازم به يادآوري است كه در هنگام كار كردن با فيلتر نيترو سلولز بايد از دستكش استفاده شود.
خلاصه مراحل كلي آزمايش وسترن بلات
آماده‌سازي نمونه
جداسازي پروتئين‌هاي موجود در نمونه توسط SDS-PAGE
انـتقـال پـروتئيـن‌هـاي جـداسـازي شـده بـر روي ژل به غشا
رنـگ آمـيـزي كـردن پـروتـئـيـن‌هـاي بلات شده بر روي غشا
پـوشـاندن جايگاه‌هاي غير اختصاصي بر روي غشا با محلول‌هاي بلوكه كننده
مــجـــاور ســـاخــتـــن غــشـــا بـــا آنــتـــي بــادي اختصاصي پروتئين هدف
مـجـاور سـاخـتـن غشا با آنتي بادي ثانويه نشاندار شده با بيوتين
اضافه كردن آنزيم نشاندار
اضـافـه كـردن سـوبـسـتـراي مـنـاسـب بـراي آنزيم مورد استفاده
بررسي نتايج به‌دست آمده
منبع: نشریه مهندسی پزشکی شماره ۱۳۰، مراد رستمی و معصومه جرفی